肖青青|王忠菊|王祖定|王飞飞|雷婷
中国大理大学药学院，大理671000
摘要
云南松（Pinus yunnanensis），一种原产于中国的植物，其产生的繁殖球果提取物（PAE）在先前的体外细胞研究中显示出抗HIV活性。然而，其抗HIV活性成分及其在体内的吸收和代谢行为仍不清楚。本研究旨在通过结合体内代谢分析、网络药理学和分子对接的综合策略，筛选PAE中的潜在抗HIV活性成分并系统地研究它们的代谢过程。研究中共检测到146种化合物；进一步分析后确定了139种原型成分和59种具有显著差异的代谢物，其中79种原型成分被预测为具有抗HIV活性。经过进一步筛选，前20种核心成分被纳入后续分析，最终确定3,4-二芳基四氢呋喃、皮马酸、Leoheteronin A和异皮马酸为最具前景的核心候选物质。网络药理学研究表明，这些成分的抗HIV作用可能是通过与AKT1、IL6、IL1B和TNF等关键靶点的相互作用以及调节AGE-RAGE和TNF等关键信号通路来实现的。分子对接证实了这些成分与核心靶点之间的强结合亲和力（结合能<−5.0 kcal/mol）。本研究系统地阐明了PAE中潜在抗HIV成分在体内的吸收和代谢规律，将静态的成分鉴定转变为全面的动态药代动力学特征，为后续相关研究奠定了重要基础。
引言
获得性免疫缺陷综合征（AIDS）由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起，是一种严重的全球性传染病，主要攻击CD4+ T淋巴细胞，通过性接触、受污染的血液或血液制品以及围产期传播[1]。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2024年全球约有4080万人（3700万至4560万）感染HIV，同年有63万人死于HIV相关疾病。尽管在预防和治疗方面取得了进展，HIV仍然是一个重大的全球公共卫生挑战。抗逆转录病毒疗法（ART）能够控制疾病，但需要终生服药——停药会导致潜伏病毒重新激活，长期使用还会引起副作用（如胃肠道反应[2]、肝肾损伤）以及病毒突变导致的耐药性[2][3]。因此，迫切需要寻找毒性低且不易产生耐药性的天然活性化合物。
云南松的球果（PAE）主要分布于中国西南部，包括云南、西藏、四川、贵州和广西等省份[4]，富含多糖、二萜类和其他生物活性成分，具有抗病毒、抗氧化和抗HIV特性[5]。同时，其他松属植物也表现出抗HIV活性。例如：朝鲜松（Pinus koraiensis）的活性成分是一种酸性多糖，具有较低的毒性，据推测可以干扰HIV的吸附/侵入或病毒复制[6]。日本白松（Pinus parvifloria）的活性成分是聚合物苯丙素类，具有较低的毒性和广谱抗HIV活性，通过抑制HIV-1逆转录酶、改变宿主细胞的细胞内微环境并诱导新的可溶性因子来发挥抗HIV作用[7]。值得注意的是，云南松球果的特定提取物表现出广谱、强效的抗HIV作用。先前的研究证实了其对HIV侵入/转录的抑制作用，具有较低的最大有效浓度（EC50）和较高的选择性指数（SI）[5]，表明其具有高效的病毒抑制作用且细胞毒性较低。这种生化特性表明其具有很高的抗HIV药物开发潜力。尽管PAE资源丰富且成本低廉，但它们通常被作为燃料焚烧，浪费了这一具有显著抗HIV潜力的宝贵资源[8]。这种未充分利用的情况凸显了探索PAE治疗价值的紧迫性。然而，该领域仍存在一些关键研究空白：（1）导致这种抗HIV活性的具体化合物尚不清楚；（2）缺乏关于潜在核心靶点和相关信号通路的系统分析；（3）对PAE潜在活性成分的体内吸收和代谢过程的研究不足。
顺序代谢理论专注于多组分口服药物，通过五个消化阶段（胃[9]、肠腔[10]、微生物群[11]、肠细胞[12]、肝脏[13]）来探讨成分的代谢命运。这种方法特别适合研究PAE，因为它可以系统地分析其多种生物活性成分的代谢变化，这与这些球果的多组分特性高度契合，有助于深入研究其代谢和药效机制[14]。为解决这些研究空白，本研究旨在：（1）使用UPLC-MS/MS技术鉴定PAE的化学成分；（2）结合网络药理学和分子对接技术筛选潜在的抗HIV化合物及其对应的靶点和信号通路；（3）利用体外肠道模型研究这些潜在活性成分的吸收和代谢过程。
仪器设备
本研究使用了以下仪器：5424R离心机（Eppendorf，德国）、Biomek i5自动化工作站（Beckman Coulter，美国）、CentriVap离心浓缩器（LABCONCO，美国）和KQ5200E超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，中国）。此外还使用了MS105DM分析天平（精度：0.01 mg；Mettler Toledo，瑞士）和MU-G02-0448恒温金属浴搅拌器（杭州缪欧仪器有限公司）。
PAE的制备
将十公斤粗磨的PAE在室温（25±2°C）下用85%乙醇（每次提取4升）提取两次，每次提取时间为24小时。乙醇提取物通过Whatman No. 1滤纸过滤，残渣再用热水（80±5°C）提取2小时。过滤后，残渣用碱性溶液（1 M NaOH，1:10 w/v）处理24小时，然后过滤得到碱性提取物。碱性提取物的pH值
原型成分的鉴定
借助数据分析软件并结合Mettware数据库，从PAE中检测到146种化学成分（表1）。这些成分可分为7大类：酚酸（27种）、黄酮类（20种）、醌类（2种）、木脂素和香豆素（12种）、生物碱（22种）、萜类（35种）和其他化合物（28种）。云南松球果提取物的总离子色谱图在正离子和负离子模式下提供于补充材料中。
讨论
通过结合UPLC-MS/MS、顺序代谢和网络药理学，本研究系统地阐明了PAE复杂的化学组成及其原型成分进入血液后的潜在抗HIV机制。值得注意的是，进入血液的成分是发挥体内药理作用的关键基础——只有那些有效进入循环系统、达到治疗靶点并保持有效血浆浓度的成分才能发挥作用。
作者贡献声明
肖青青：撰写初稿、进行实验研究、数据管理。王忠菊：撰写初稿、进行实验研究、数据管理。王祖定：进行实验研究、争取资金、数据管理。王飞飞：进行实验研究、争取资金、数据管理。雷婷：撰写、审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法设计、进行实验研究、争取资金、进行正式分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
