罗泽凡|吴美琪|卢丽雪|胡慧静|谢银春|王少翔|陈雅琪|徐静怡|陈巧莉|孟世石|单雅琴|李江林|王晓
中国广东省湛江市广东医科大学药学院
摘要
吴茱萸（Evodia rutaecarpa）是一种传统中药（TCM），具有很高的药用价值，在治疗肿瘤和阿尔茨海默病方面显示出巨大潜力。然而，其对抗食管癌的有效成分及其潜在的分子机制仍不清楚。本研究采用超高效液相色谱-轨道阱质谱（UPLC-Orbitrap-MS）技术分析了吴茱萸的化学成分。通过TCMSP、SwissADME和BATMAN-TCM数据库鉴定关键成分，并使用SwissTargetPrediction进行靶点预测。从OMIM、GeneCards和TTD数据库中检索潜在的治疗靶点。利用Cytoscape和STRING构建了“药物-成分-靶点”网络，并进行了GO/KEGG富集分析。使用Schrödinger Maestro进行了分子对接和动力学模拟。在食管鳞状细胞癌细胞上通过CCK-8、EdU、IF检测和Western blot分析进行了体外验证。本研究共鉴定出13种活性成分和127个潜在靶点。GO/KEGG分析显示这些成分在细胞周期调控中起关键作用。6-羟基木犀草素、异鼠李素和吴茱萸碱被确定为主要活性成分。分子动力学模拟证实它们与CDK2、SRC和EGFR等关键靶点有强结合力。体外实验表明，6-羟基木犀草素和异鼠李素显著抑制细胞增殖，上调γ-H2AX表达水平，诱导细胞周期停滞并最终引发细胞凋亡。研究表明，吴茱萸通过多种成分、靶点和途径发挥抗食管癌作用，为其在治疗食管癌中的应用提供了理论基础。
引言
食管癌是一种起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，在全球发病率中排名第八，在癌症相关死亡率中排名第六[1]。主要分为两种类型：食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。全球约90%的病例为ESCC，主要集中在南美洲和“亚洲食管癌带”，而EAC在欧洲和北美高收入地区更为常见[2]。在中国，ESCC占病例的97.1%[3]。ESCC预后较差，5年生存率仅为12–20%[1]。大多数患者确诊时已处于晚期，目前的治疗方法主要依赖药物治疗，但效果有限且毒性较大，常伴有药物耐药性[4],[5]。例如，一线化疗药物顺铂初期有效，但长期使用或癌症复发后效果显著下降。因此，开发低毒性、高疗效、具有多组分、多靶点和多途径协同作用的抗肿瘤药物已成为研究重点。
中药在抗癌研究中显示出显著价值。近年来，从草药中分离出许多生物活性化合物，并通过实验和临床验证证实其能够抑制肿瘤生长。吴茱萸及其活性成分具有多种药理活性，包括止泻、抗炎、抗氧化、抗菌、镇痛、抗胃溃疡、保护心脏、抗阿尔茨海默病和抗肿瘤作用[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12]。其化学成分复杂，主要包括生物碱、萜类、黄酮类、蒽醌类、柠檬苦素、酚酸、甾体和苯丙素[13],[14],[15],[16],[17]，这些成分共同构成了其多靶点药理作用的基础。然而，吴茱萸的具体活性成分和作用机制仍存在争议，缺乏系统的整理和深入研究。
在此背景下，网络药理学作为一种强大的工具，有助于阐明中药的药效学基础和机制，因为它能够从整体网络层面系统分析复杂的“多组分、多靶点、多途径”相互作用[18],[19]。
现有研究表明，吴茱萸在多种恶性肿瘤（包括结直肠癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤）中具有潜在的治疗价值[20],[21],[22]，为其在肿瘤学中的应用奠定了基础。同时，网络药理学在食管癌研究中的应用也日益成熟，先前的研究成功揭示了姜黄素、连翘苷A和
Daphne altaica在治疗食管癌中的作用机制[23],[24],[25]，进一步验证了这种方法的有效性。
值得注意的是，吴茱萸的活性成分（如吴茱萸胺、异鼠李素和吴茱萸碱）已被证明具有抗食管癌潜力[26],[27],[28]。这使吴茱萸成为抗食管癌治疗的潜在候选药物，其应用前景得到学术界的广泛认可。然而，目前尚不清楚吴茱萸抗食管癌的核心活性成分及其涉及的靶点和途径，对其药效学机制的理解也不完整。尽管网络药理学在食管癌研究领域已得到广泛应用，且吴茱萸活性成分的抗食管癌潜力已初步得到验证，但尚未有研究应用网络药理学技术来解析其抗食管癌机制。
为了系统阐述吴茱萸抗食管癌的网络药理学机制，本研究创新性地整合了多种数据库资源，有机结合了网络药理学、分子对接和分子动力学模拟技术，形成了一个“多技术协同”的研究方案。通过筛选和分析吴茱萸抗食管癌作用的关键靶点和途径，构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并进行了多层次信号通路富集分析，从整体角度全面解释了吴茱萸的功能和机制基础。结果表明，吴茱萸通过多组分、多靶点和多途径的协同作用发挥治疗效应，其中6-羟基木犀草素、异鼠李素和吴茱萸碱被确定为核心活性成分。通过将网络药理学与中药理论相结合，本研究不仅丰富了中药多组分协同作用的科学内涵，还为解释传统方剂的现代抗癌价值提供了新的研究范式，为后续吴茱萸在食管癌治疗中的临床转化研究奠定了重要基础。
吴茱萸化学成分的UPLC-Orbitrap-MS分析
本研究使用Thermo Ultimate 3000超高效液相色谱（UHPLC）系统（Thermo Fisher Scientific，美国）进行色谱分离，配备ACQUITY HSS T3 C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）。质谱分析采用UPLC-Orbitrap-MS系统。流动相由乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）组成，梯度洗脱程序如下：0–4 min，10–30% B；4–6 min，30–45% B；6–9 min，45% B；9–10 min，100% B
吴茱萸提取物的UPLC-Orbitrap-MS结构鉴定及关键成分的数据库补充和筛选
利用UPLC-Orbitrap-MS结合质谱数据、参考标准物的碎片模式及相关文献信息，鉴定吴茱萸的化学成分。随后从TCMSP、ETCM v2.0和BATMAN-TCM v2.0数据库中检索了额外化合物。根据口服生物利用度（OB ≥ 30%）和药物相似性（DL ≥ 0.18）的初步筛选标准，共获得30个候选化合物。SMILES序列...
讨论
通过整合UPLC-Orbitrap-MS实验结果、网络药理学、批量分子对接、分子动力学模拟和体外细胞实验，本研究系统揭示了吴茱萸抗食管癌的“多组分、多靶点、多途径”作用机制。共鉴定出127个潜在靶点，其中SRC、PIK3CA、PIK3CB、JAK2、PTK2、CDC25A、AKT1、EGFR、CDK2和CDK4为核心调控靶点。
结论
本研究系统揭示了吴茱萸抗食管癌作用的核心机制和关键生物活性物质，为其在食管癌治疗中的应用提供了科学依据。研究表明，6-羟基木犀草素和异鼠李素是吴茱萸抗食管癌的主要活性成分，它们通过抑制细胞...
CRediT作者贡献声明
王少翔：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。
陈雅琪：验证，数据管理。
徐静怡：验证。
单雅琴：软件应用，方法学研究，概念构思。
李江林：验证，软件应用，方法学研究，数据管理。
罗泽凡：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，验证，软件应用，方法学研究，数据分析，概念构思。
陈巧莉：验证。
孟世石：验证。
胡慧静：验证，软件应用，数据管理。
本研究分析的数据来自癌症基因组图谱（TCGA）。所有生成或分析的数据均包含在本文及其补充材料中。研究中生成或使用的代码可向相应作者索取。
作者声明在撰写和提交本手稿过程中不存在利益冲突。
本研究得到了国家自然科学基金（82373126, 32000516）、深圳市科技项目（JCYJ20220818102605011, JCYJ20220531101016035, JCYJ20210324093602007, JCYJ20190809165805604）、深圳市重点实验室（ZDSYS20200811142804014）、神经科学与肿瘤药物开发国家重点实验室（SKLSIM-2024085）以及国家自然科学基金（82404782）和广东省基础与应用基础研究基金的支持。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
作者感谢癌症基因组图谱（TCGA）提供的平台以及上传宝贵数据集的贡献者，这些数据对研究的顺利完成至关重要。在研究过程中使用了Schrödinger Maestro 12.9软件进行分子对接。特别感谢济南大学提供的支持，以及王晓博士提供的Schrödinger Maestro 12.9软件。
