1 引言
血红蛋白(Hb)基氧载体(HBOC)是在血液无法即时获取时，作为红细胞(RBC)的一种有前景的临时替代品。这类载体利用Hb独特的氧结合特性，同时对分子进行修饰，以防止循环系统中无细胞血红蛋白带来的有害副作用。这些修饰包括血红蛋白聚合、表面共轭聚乙二醇(PEG)、血红蛋白封装于颗粒内或形成固体血红蛋白纳米颗粒。聚合血红蛋白(PolyHb)是目前最成熟的HBOC，但因其制备物中存在无细胞Hb和低分子量聚合物(<500 kDa)而可能导致副作用，尚未获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准。其他方法如血红蛋白表面PEG化虽然增加了分子量和循环半衰期，但也可能导致氧化速率加快、血红蛋白四聚体二聚化及血红素丢失。血红蛋白囊泡(HbV)虽能保持Hb的天然功能，但其封装效率低，需要输注更高的脂质负载以运输相同量的氧气。
相比之下，血红蛋白纳米颗粒(Hb-NP)通过去除HbV相关的脂质层，生成仅由血红蛋白组成的颗粒，具有合成成本低、物理性质一致、控制释放和生物利用度高等优点。蛋白质纳米颗粒可通过乳化、反溶剂沉淀、纳米喷雾干燥、电喷雾和共沉淀等多种方法合成。本研究聚焦于反溶剂沉淀法合成蛋白质纳米颗粒(dNP)，因为该方法已被证明是一种可规模化、经济且程序直接的合成路线，无需特殊设备。该方法通过加入反溶剂强制蛋白质沉淀形成纳米颗粒。颗粒的尺寸和均一性受溶剂与反溶剂选择、蛋白质起始浓度、反溶剂添加速率、搅拌速度、混合方式、溶剂与反溶剂的体积比以及温度等多种因素影响。本研究确定了利用人血红蛋白(hHb)合成纳米颗粒(称为hHb-dNPs)所需的适宜参数，并对其进行了全面表征，包括合成可扩展性和颗粒随时间变化的稳定性。
2 材料与方法
研究所用材料包括来自Leuconostoc spp.的右旋糖酐(MW ~40 kDa)、甘氨酸、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、氰基硼氢化钠(NaCNBH3)等。氧化右旋糖酐(odex)通过高碘酸钠氧化右旋糖酐合成，并使用DNPH醛活性测定法测定其醛基活性。人血红蛋白(hHb)从过期人红细胞中纯化获得。
2.1 小规模纳米颗粒合成
纯化的hHb用去离子水缓冲交换并稀释至7.86 mg/mL。溶液在冰上保持，以500 rpm搅拌，同时以3 mL/min的速率加入乙醇(体积为起始体积的1.5倍)。乙醇加入完毕后，加入odex溶液(20 mg/mL)，其醛基与hHb伯胺的摩尔比为2:1。混合物在4°C反应2小时。反应后，使用0.05 μm切向流过滤(TFF)模块进行缓冲交换，以去除乙醇。随后缓慢加入氰基硼氢化钠(NaCNBH3)以还原希夫碱，再使用1 M甘氨酸(pH 7.4)进一步淬灭反应。最后，将hHb-dNPs缓冲交换至磷酸盐缓冲液(PBS)中并浓缩。
2.2 放大规模合成
为展示合成路线的可扩展性，将起始体积放大100倍至500 mL。保持起始hHb浓度、乙醇与起始溶液体积比及交联反应时间不变。乙醇添加速率提高至70 mL/min，以限制添加时间在10分钟内。使用基于叶轮的反应容器确保快速均质化。纯化步骤与小规模类似，但使用了更大表面积(SA = 1000 cm2)的TFF模块。
2.3 表征方法
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粒径与分布：使用可调电阻脉冲传感(TRPS)在qNano Gold仪器上测量。分布跨度(span)根据d90、d10和d50计算。
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表面电势(Zeta Potential)：使用马尔文Zetasizer Helix仪器测量。
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血红蛋白与高铁血红蛋白浓度：使用氰化高铁血红蛋白(Drabkin)法通过紫外-可见光谱测定。
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形貌：使用扫描电子显微镜(SEM)观察。
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氧平衡曲线(OEC)：使用Hemox分析仪测量，并通过Hill方程回归计算P50(氧亲和力)和nH(协同系数)。
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血液相容性：将hHb-dNPs与新鲜全人血混合孵育，通过测量上清液中的游离血红蛋白评估溶血率。溶血率低于5%视为血液相容。
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储存稳定性研究：将hHb-dNPs分别与5 wt%人血清白蛋白(HSA)、20 mM海藻糖或不添加冻存保护剂共同储存于4°C、-20°C或-80°C，为期28天。在指定时间点解冻样品，并进行全面的生物物理表征。
3 结果与讨论
3.1 小规模hHb-dNP合成与表征
小规模(5 mL起始体积)合成的hHb-dNPs产率为56.9 ± 12.0%，表面电势为-31.8 ± 2.7 mV。颗粒平均直径为138.3 ± 6.5 nm，分布跨度为0.28 ± 0.04，表明粒径分布均匀。SEM图像证实颗粒为球形，尺寸在100-200 nm之间。
氧平衡曲线显示，小规模hHb-dNPs的P50为0.88 ± 0.27 mm Hg，nH为0.72 ± 0.05。其OEC相对于天然hHb向左移动，且失去了典型的S形特征，协同性降低(nH≤ 1)，这与大多数经过化学交联的HBOC类似。其OEC与处于松弛(R)四元态的聚合人血红蛋白(R-state PolyhHb)几乎相同。
3.2 大规模hHb-dNP合成与表征
大规模(500 mL起始体积)合成的hHb-dNPs在产率、平均粒径(142.8 ± 7.9 nm)、分布跨度(0.35 ± 0.05)和表面电势(-29.0 ± 2.6 mV)方面与小规模合成结果无显著差异(p > 0.05)。
其P50为2.16 ± 0.50 mm Hg，nH为0.92 ± 0.04，虽与小规模结果有统计学显著差异(p < 0.05)，但仍处于R态HBOC的范围。氧平衡曲线比较显示，无论规模大小，hHb-dNPs均表现出与R-state PolyhHb相似的高氧亲和力。
3.3 血液相容性
将hHb-dNPs与全人血混合孵育后，测得的溶血率为3.3 ± 1.4%，低于5%的阈值，表明其具有血液相容性。
3.4 储存稳定性研究
为期28天的储存研究表明，储存条件和冻存保护剂对hHb-dNPs的稳定性有显著影响。
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定性观察：储存在-20°C且无冻存保护剂或仅用海藻糖的样品在第4天出现胶凝。储存在-80°C且无冻存保护剂或用海藻糖的样品出现聚集，而与HSA共存的样品在-80°C下未观察到聚集。在4°C下，与HSA共存的样品颜色迅速变为锈棕色，提示氧化加速。
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血红蛋白与高铁血红蛋白浓度：在-80°C下，所有样品的Hb浓度保持相对稳定，高铁血红蛋白(metHb)水平在整个研究期间保持在低于5%。在4°C下，与海藻糖或无冻存保护剂共存的样品，其metHb水平随时间呈线性增加，至第28天约为5%；而与HSA共存的样品氧化速率更快，第28天时metHb超过10%。
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粒径分布：在4°C下，无论使用何种冻存保护剂，颗粒平均直径和跨度在28天内均保持恒定。在-80°C下，与HSA共存的颗粒平均直径和跨度保持恒定，而与海藻糖或无冻存保护剂共存的颗粒在早期出现轻微增加后趋于平稳，这与观察到的聚集现象一致。
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氧结合性质：所有样品的P50在储存期间均维持在约2 mm Hg左右，但在第14天出现短暂下降。Hill系数(nH)则稳定保持在1左右，表明非协同性氧结合性质未受储存条件影响。
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表面电势：所有样品的表面电势在28天的储存期内均保持在约-30 mV，不受储存条件或冻存保护剂的显著影响。
综合来看，hHb-dNPs在-80°C下与HSA作为冻存保护剂共同储存是最佳条件，颗粒在此条件下无聚集或降解迹象，且保持了较低的氧化速率。
4 结论
本研究成功演示了利用反溶剂沉淀法合成人血红蛋白纳米颗粒(hHb-dNPs)。该合成路线可规模化，所得颗粒具有均一的尺寸(130-150 nm)、球形形貌和负表面电势，且具备血液相容性。hHb-dNPs表现出高氧亲和力及降低的协同性，类似于松弛态聚合血红蛋白。储存稳定性研究表明，在-80°C下与人血清白蛋白(HSA)共存时，颗粒可稳定储存长达一个月，其均一的粒径分布和氧结合性质得以维持。hHb-dNPs是一种有潜力的新型血红蛋白基氧载体(HBOC)候选物，未来可通过优化进一步提高产率和氧亲和力，以满足输血医学等应用需求。此外，该平台技术可能允许与氧气载体共同递送药物或其他活性剂，从而将HBOC的应用范围扩展到药物递送领域。
