脂滴调控的多途径诱导I型干扰素反应，用于铁死亡与免疫协同治疗肿瘤

通过铁死亡和IFN-I风暴协同作用抑制肿瘤转移并建立免疫记忆，同时调控炎症副作用的纳米药物递送系统研究。

任斌|马浩龙|李宗恒|杨静|范庆登|陈春梅|吴国超|黄琳|陈新宇|马文杰|白天水|王泽辉|邓志勤|王珏|刘刚|沈泽宇|宁世鹏

南方医科大学生物医学工程学院，中国广东省广州市沙 tai 南路 1023 号，邮编 510515

摘要

刺激因子干扰素基因（STING）的上游信号多种多样，而 STING 介导的肿瘤免疫疗法的关键在于诱导 I 型干扰素（IFN-I）的产生。本文开发了一种负载有 Tacrine (TCR) 和 SR717 的中孔二氧化锰纳米粒子（TCR-SR717@HMMD NPs，简称 iTempest），通过多种途径在肿瘤中触发铁死亡（ferroptosis）和大量产生 IFN-I（即 IFN-I tempest）。其可行性和机制已通过体外实验得到验证。肿瘤细胞的铁死亡和 IFN-I tempest 能够有效抑制肿瘤转移并建立免疫记忆，从而发挥强大的抗肿瘤作用。体外和体内实验均显示出显著的抗肿瘤效果，且 iTempest 在磁共振成像（MRI）方面表现优异。此外，由于积累的脂滴会抑制树突状细胞（dendritic cells）的成熟，进而影响 CD8⁺ T 细胞的表达，因此 iTempest 还能控制治疗后期可能由 IFN-I tempest 引发的炎症副作用。多余的 IFN-I 最终会被溶酶体中的酸性水解酶降解，防止局部炎症。小鼠体重监测、血液学分析和组织学检查表明 iTempest 具有良好的生物相容性和生物安全性。

引言

刺激因子干扰素基因（STING）将抗肿瘤反应与先天免疫联系起来 [1]。细胞内的异常双链脱氧核糖核酸（dsDNA）可被 DNA 传感器（即环鸟苷单磷酸（cGMP）-腺苷单磷酸（AMP）（cGAS）合成酶（cGAS）识别并结合，从而诱导第二信使环二核苷酸（CDNs）的产生，这些 CDN 是 STING 的天然激动剂，进而激活 STING 通路 [2], [3], [4]。然而，CDNs 及其配体的不稳定性限制了 STING 在体内的免疫反应 [5]。非核苷酸 STING 激动剂的研究已成为一个新的研究热点 [6]。已报道的非核苷酸 STING 激动剂无需 cGAS 激活即可直接诱导 STING 蛋白的构象变化，从而触发下游信号传导。此外，少量 Mn²⁺ 可显著增强 cGAS 对 dsDNA 的敏感性，提高对病毒 DNA 的监测能力并大幅增加 CDN 的合成 [7]。同时，Mn²⁺ 还能显著增强 STING 与 cGAMP 的结合能力 [8]。因此，Mn²⁺ 离子具有双重功能，可被视为一种上游信号通路。

大多数已报道的方法都涉及递送 STING 激动剂以激发先天免疫 [9], [10], [11]。STING 通路介导的肿瘤免疫杀伤的关键在于分泌 I 型干扰素（IFN-I），后者可以招募并激活树突状细胞（DCs），进而诱导 T 细胞攻击肿瘤。然而，过量的 IFN-I 也会引发局部炎症 [12], [13]，尤其是在肿瘤即将被清除时。

为了解决上述问题，开发了负载有 Tacrine (TCR) 和 SR717 的中孔二氧化锰纳米粒子（TCR-SR717@HMMD NPs，图 1a），以在肿瘤中触发铁死亡和大量产生 IFN-I（即 IFN-I tempest）。TCR-SR717@HMMD NPs 被命名为 iTempest，是因为其特性类似于大气科学中的风暴生成、发展和消散过程 [14]。图 1b 展示了 iTempest 在早期通过多种途径触发 IFN-I tempest，中期实现强效肿瘤杀伤和抗肿瘤转移及免疫记忆，后期则调节局部炎症反应。当 iTempest 通过增强渗透性和保留（EPR）效应在肿瘤中积累时（图 1b），微酸性肿瘤环境（TME）会导致中孔二氧化锰壳逐渐降解为游离的 Mn⁴⁺，从而使 TCR 和 SR717 释放到肿瘤中。由于 TME 中谷胱甘肽（GSH）浓度较高，Mn⁴⁺ 可被还原为 Mn²⁺。肿瘤中高浓度的 SR717 和 Mn²⁺ 可直接激活肿瘤细胞的 STING 通路，产生 IFN-I。Mn²⁺ 也会扩散到周围区域，激活树突状细胞（DCs）的 STING 通路。TCR 会诱导线粒体 DNA（mtDNA）泄漏，促进 CDN 的合成，增加肿瘤中 STING 激动剂的浓度，进而促进 IFN-I 的产生。Mn⁴⁺ 对 GSH 的消耗会导致 GSH 过氧化物酶 4（GPX4）下调，进而产生活性氧（ROS），导致细胞膜脂质过氧化和肿瘤细胞铁死亡 [16], [17], [18]。过量的 IFN-I 可显著促进 DCs 的成熟和分化，唤醒 CD8⁺ T 细胞和自然杀伤细胞（NK）攻击肿瘤细胞 [19], [20]。晚期积累的脂滴会降低 DCs 的成熟和分化程度，从而减少 T 细胞活性并防止局部炎症。

材料

四水合氯化锰（MnCl₂·4H₂O，99.9%）、四乙基正硅酸盐（TEOS）和六偏磷酸钠由 Macklin 公司提供。Tacrine（≥ 98%，TCR）购自 ACMEC 公司。罗丹明（R6G）购自 Sigma-aldrich（美国）。SR717 由武汉琼格生物科技有限公司提供。

二氧化硅纳米粒子（SLNP）的合成

首先向圆底烧瓶中依次加入 74 mL 无水乙醇和 10 mL 纯水，随后加入 0.90 mL 氨水溶液（28%）和 2.0 mL TEOS（> 99.99%）

iTempest 的表征

采用 Stöber 方法制备 SLNP，通过调节 NH₃·H₂O 和四乙基正硅酸盐（TEOS）的投料量来控制粒子直径 [21]。当 NH₃·H₂ 的体积从 1.0 mL 降至 0.70 mL 时，SLNP 的直径从 89 nm 降至 36 nm，回收率从 91.2 ± 1.7% 显著降至 14.1 ± 7.1%。SLNP1–4 的回收率和代表性透射电子显微镜（TEM）图像分别显示在表 S1 和图 S1 中。

结论

总结来说，我们设计并制备了名为 iTempest 的 TCR-SR717@HMMD NPs，通过多种途径在肿瘤中触发铁死亡和 IFN-I tempest，实现了高效的肿瘤治疗，并抑制了肿瘤复发和转移。体外和细胞实验验证了 iTempest 通过多种途径诱导 IFN-I 暴风雨的可行性和机制。当 HMMD NPs 在酸性肿瘤微环境（TME）中降解后，其出色的磁共振成像能力使其能够实现可视化检测

CRediT 作者贡献声明

任斌：撰写原始稿件、数据可视化、验证、软件使用、方法设计、实验研究、数据分析、概念构思。马浩龙：撰写原始稿件、数据可视化、验证、软件使用、实验研究、数据分析。李宗恒：撰写原始稿件、数据可视化、验证、软件使用、实验研究、数据分析。杨静：数据可视化、验证、软件使用、方法设计、实验研究、数据分析。范庆登：数据可视化、验证

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32271374、82473348、82303797）、广东省自然科学基金（项目编号：2024A1515012639）以及广州市重点研发计划（项目编号：2025B01J3007）的资助。