枣树植原体耐受与易感基因型的表型差异
为了探究植原体感染的影响，研究团队将易感基因型‘伏香’(Fu)和耐受基因型T13的接穗分别嫁接在健康和染病的‘伏香’砧木上，并在一年内的三个生长阶段(S1–S3)观察表型。结果表明，在S1阶段，两个基因型均表现出枣疯病症状，但T13的症状不如Fu严重。Fu植株出现了腋芽萌发、枝条增生和叶片变小，而T13仅观察到腋芽萌发。到了S2阶段，Fu植株表现出典型的叶变、丛枝和叶片变小等严重症状，而T13植株的症状得到恢复，表现出正常的枝条和叶片。至S3阶段，Fu的病症加剧，而感染的T13植株则无症状生长。通过检测植原体标志基因ZjTMK的表达水平，证实了Fu中植原体含量从S1到S3阶段显著增加，而在T13中则维持在较低水平，从而确认Fu为易感基因型，T13为耐受基因型。
转录组谱揭示耐受与易感基因型的分子响应差异
通过对三个生长阶段的样本进行转录组测序，研究团队系统分析了Fu和T13在植原体感染下的基因表达变化。在Fu中，三个阶段的差异表达基因(DEGs)数量分别为2287、1971和7387个；在T13中，则分别为2771、2387和1798个。分析发现，T13在早期阶段(S1和S2)就表现出比Fu更为显著的转录组变化，而Fu则在后期(S3)出现大量的DEGs。基因本体(GO)富集分析显示，不同阶段的DEGs参与了不同的生物过程，例如Fu在S1阶段的DEGs富集于DNA甲基化调控等过程，而T13则富集于脱落酸激活的信号通路等。通过比较Fu和T13之间表达模式相反的DEGs，研究人员发现，蛋白质磷酸化、代谢物生物合成和细胞分化等关键生物过程的转录调控，可能是导致两者植原体耐受性差异的重要原因。
代谢组学分析揭示耐受相关的代谢物变化
利用广泛靶向代谢组学技术，研究团队进一步比较了Fu和T13在植原体感染下的代谢物积累差异。主成分分析(PCA)显示，Fu的健康与感染样本明显分离，而T13的分离程度较小，尤其在S3阶段。这表明Fu在感染后发生了更剧烈的代谢物变化。共鉴定出232种代谢物，包括羧酸衍生物、脂肪酰基、有机氧化合物等。差异积累代谢物(DAMs)分析显示，Fu和T13在不同阶段均积累了独特类型的代谢物。通过聚类分析和维恩图，研究人员聚焦于在Fu中下调而在T13中上调（或反之）的关键代谢物。这些代谢物包括类黄酮及其糖苷（如异杜荆素查尔酮）、酚酸及其衍生物（如水杨酸-2-O-葡萄糖苷）、多种糖及其衍生物（如D-葡萄糖6-磷酸）等。这些代谢物的差异积累可能构成了T13耐受植原体的生化基础。
转录组与代谢组关联分析锁定关键调控因子
通过整合转录组和代谢组数据并进行关联分析，研究人员发现，在“Fu下调_T13上调”的比较组中，47个DAMs与数个关键DEGs显著相关，其中最值得注意的是WRKY转录因子40 (LOC107406933，即ZjWRKY40)。在另一个比较组中，9个DAMs则与ZjWRKY71等基因相关。值得注意的是，WRKY转录因子已被证明在调控枣树植原体感染中发挥重要作用。这些相关性分析表明，WRKY转录因子可能通过调节特定次生代谢物的生物合成，在塑造Fu和T13之间差异症状中扮演关键角色。
ZjWRKY40在枣树植原体耐受中的核心功能验证
转录组数据和逆转录定量PCR(RT-qPCR)分析均证实，ZjWRKY40在耐受基因型T13中被显著诱导表达，其在S1和S3阶段的表达量分别是Fu中的13倍和7倍。相反，ZjWRKY71和ZjWRKY53在易感基因型Fu的S3阶段表达显著上调。鉴于ZjWRKY40在两者间的表达差异最为显著，研究人员选择对其进行功能鉴定。通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术在枣树中瞬时沉默ZjWRKY40，发现沉默植株出现了典型的枣疯病症状——腋芽萌发，而野生型植株则无此症状。这直接证明了ZjWRKY40的表达与枣树的植原体耐受性呈正相关。
ZjWRKY40靶向zju-miR157并调控其表达
为了阐明ZjWRKY40的分子机制，研究人员探寻了其靶基因。鉴于微小RNA(miRNA)在植物响应植原体感染中的重要作用，他们检测了ZjWRKY40与zju-miR157启动子的相互作用。酵母单杂交(Y1H)实验表明，ZjWRKY40能够结合zju-miR157的启动子并激活报告基因。电泳迁移率变动分析(EMSA)进一步证实了ZjWRKY40对该启动子序列的特异性结合能力。体内双荧光素酶报告实验则显示，共表达35S::ZjWRKY40和zju-miR157Pro-LUC能显著增强荧光信号，而共表达SJP4JWB、ZjWRKY40和zju-miR157Pro-LUC能进一步放大此信号。这些结果强有力地证明，ZjWRKY40通过直接靶向zju-miR157的启动子来增强其转录，而SJP4JWB可能作为共调节因子放大这一效应。
zju-miR157负调控植原体耐受性
对zju-miR157表达模式的分析发现，其在易感基因型Fu的植原体感染植株中显著诱导，而在耐受基因型T13中，其表达在S1阶段上调后，于S2和S3阶段（即症状恢复期）显著下降。为了验证其功能，研究人员在拟南芥、杨树中过表达zju-miR157，并在枣树中瞬时过表达。结果表明，过表达植株均表现出更多的枝条分支、罗勒叶或腋芽萌发等类似枣疯病的症状。同时，在过表达zju-miR157的拟南芥中，其靶基因AtSPL10和AtSPL11的表达水平下降。这些实验证明，zju-miR157通过下调SPL基因的表达，负调控枣树对植原体的耐受性。
ZjSPL3是植原体耐受的正调控因子
由于ZjSPL3是已知调控枣疯病症状的zju-miRNAs的主要靶标，研究人员检测了其在Fu和T13中的表达。结果显示，ZjSPL3在T13的所有阶段均显著上调，而在Fu中则下调。这表明较高的ZjSPL3表达可能有助于T13的耐受表型。对拟南芥中ZjSPL3同源突变体(AtSPL2/10/11)的表型观察发现，突变体出现了更多的枝条分支，进一步证实了ZjSPL3与植原体耐受性呈正相关。通过序列比对和荧光素酶互补实验，确认了zju-miR157可以靶向ZjSPL3，尽管信号较弱，这提示zju-miR157可能通过调控ZjSPL3的表达来影响耐受性。
新效应蛋白SJP4JWB的鉴定及其与ZjWRKY40的互作
通过比较基因组分析，研究团队鉴定出一个新的植原体效应蛋白，命名为SJP4JWB。表达分析显示，SJP4JWB在易感基因型Fu的叶片和枝条中从S1到S3阶段被强烈诱导，而在T13中仅在S2阶段有轻微诱导，总体表达量显著低于Fu。功能验证表明，在拟南芥、杨树中过表达SJP4JWB，或在枣树中瞬时过表达，均能诱导更多的枝条分支和腋芽生长，重现枣疯病症状。基于SJP4JWB能诱导病症，研究人员假设其可能与ZjWRKY40互作。酵母双杂交(Y2H)和免疫共沉淀(Co-IP)实验均证实了SJP4JWB与ZjWRKY40之间存在直接的蛋白-蛋白相互作用。
讨论：SJP4JWB–ZjWRKY40–zju-miR157调控模块模型
基于以上研究发现，文章提出了一个调控模型来解释SJP4JWB–ZjWRKY40–zju-miR157模块如何贡献于枣树的植原体耐受性。在易感基因型Fu中，ZjWRKY40表达下调，而随着严重枣疯病症状的发展，效应蛋白SJP4JWB积累增多。高水平的SJP4JWB与ZjWRKY40共同作用，增强了zju-miR157的转录。高表达的zju-miR157抑制了其靶基因ZjSPL3的表达，最终导致枣疯病症状的形成。相反，在耐受基因型T13中，植原体感染期间ZjWRKY40表达显著上调，而SJP4JWB的表达在症状恢复期降低。SJP4JWB的较低积累，加上高水平的ZjWRKY40，导致对zju-miR157的诱导减弱，从而解除了对ZjSPL3的抑制。ZjSPL3表达的增加有助于T13抵抗枣疯病症状。该研究首次揭示了这一新颖的信号轴，为了解植物与植原体互作的分子机制提供了重要见解，并为通过靶向这一通路进行分子育种和疾病防控策略开发提供了潜在靶点。
