摘要
目的：有氧糖酵解在肝细胞癌（HCC）的增殖、转移和免疫抑制中至关重要。本研究建立HCC小鼠模型，旨在探索电针和艾灸是否可通过抑制NSUN2介导的有氧糖酵解来缓解HCC小鼠病情。
方法：通过腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）联合四氯化碳（CCl4）建立HCC小鼠模型。在艾灸组和电针组，选取双侧“肝俞”（BL18）和“足三里”（ST36）穴位进行干预。采用酶联免疫吸附法（ELISA）定量血清标志物水平。通过免疫组化（IHC）、蛋白质印迹法（Western blotting）和实时定量PCR（qRT-PCR）评估有氧糖酵解相关蛋白和mRNA的表达。采用基于MRM的靶向代谢组学量化肝脏能量代谢改变。
结果：在建模第28周完成后，肉眼观察显示明显的肝脏肿大伴形态扭曲。肝表面粗糙不规则，相邻肝叶间存在不同程度的粘连。值得注意的是，肝脏实质中散在分布着外观呈白色或暗红色、边界清晰的大肿瘤。经过总计26周的干预，与模型组相比，电针和艾灸显著降低了肝脏肿瘤数量、肿瘤负荷、平均肿瘤直径和肿瘤体积（P< 0.05）。此外，脾脏指数和肝脏指数也显著降低（P< 0.05）。治疗后，血清甲胎蛋白（AFP）及其异质体AFP-L3的蛋白水平显著下降（P< 0.05）。NSUN2和PKM2的蛋白及mRNA表达水平显著下调（P< 0.01）。与糖酵解通量受到抑制一致，己糖激酶2（HK2）的蛋白表达也显著降低（P< 0.001）。同时，艾灸降低了肝脏中早期糖酵解中间产物葡萄糖-6-磷酸（G6P）和果糖-6-磷酸（F6P）的含量（P< 0.01），而电针仅降低了G6P水平（P< 0.001）。相反，糖酵解最后一步之前的高能中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的水平则显著升高（P< 0.001）。
结论：本研究揭示，电针和艾灸均通过抑制NSUN2-PKM2糖酵解轴来减轻HCC小鼠的肿瘤增殖，从而凸显该通路作为非药物干预的新型代谢靶点；此外，艾灸独特地展现出诱导更广泛代谢应激反应的潜力。观察到的肿瘤负荷和关键生物标志物的减少证实了该方法的治疗潜力。这些临床前研究结果共同表明，电针和艾灸作为非药物辅助疗法，在调节肿瘤代谢和延缓HCC进展方面具有转化潜力，值得进一步的临床研究。
引言
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因。肝癌细胞经历广泛的代谢重编程，其特征是增强的有氧糖酵解、上调的从头脂肪生成和加速的氨基酸代谢，这些共同为其快速增殖、侵袭和转移提供必要的能量、还原当量和生物合成前体。有氧糖酵解在HCC的增殖、转移、免疫抑制和耐药性中起关键作用，其过程的改善依赖于糖酵解酶的表达和活性，并与HCC的预后密切相关。己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶1（PFK1）和丙酮酸激酶M2型（PKM2）是糖酵解过程中的关键催化酶。
NOP2/Sun结构域家族成员2（NSUN2）介导m5C表观遗传修饰，与多种癌症的发生发展密切相关。先前的研究已确定，NSUN2介导的m5C超甲基化通过靶向下游效应子PKM2来增强HCC的有氧代谢。大量临床和临床前研究探索了针灸在肝癌中的治疗或姑息作用。电针和艾灸虽然都植根于传统穴位刺激，但代表了两种不同的物理模式，具有潜在不同的主要作用机制。电针通过脉冲电流，主要经体感神经通路转导，以调节全身神经内分泌和炎症反应。艾灸则通过燃烧艾绒产生的局部热量和生物活性化合物，可能通过激活热敏受体和直接药理调节局部组织发挥作用。
鉴于HCC的代谢失调受神经信号和局部炎症微环境的双重影响，本研究旨在对这两种干预措施进行比较性研究。在晚期肝纤维化和肝硬化患者中，近90%最终会发展为肝细胞癌。因此，本研究采用DEN联合CCl4诱导的HCC小鼠模型来模拟肝脏中炎症向癌症的转变。通过聚焦于NSUN2介导的糖酵解，本研究旨在探讨艾灸和电针在预防和治疗HCC中的效果和机制。
材料与方法
动物实验与试剂：使用雄性C57BL/6J小鼠。
HCC模型建立：根据先前研究，通过腹腔注射DEN和CCl4制备HCC模型。
盲法与操作标准化：为确保完全分离随机化、实验程序和评估，由三名不同的研究者参与。
分组与干预：小鼠随机分为四组：正常组（NG）、模型组（MG）、艾灸组（MOX）和电针组（EA）。艾灸组和电针组选取双侧“肝俞”（BL18）和“足三里”（ST36）穴位进行干预。电针组连接电针仪进行刺激。干预每周三次，持续26周。
样本收集与处理：干预结束后，采集血液和肝脏、脾脏组织，进行观察、称重和保存。
酶联免疫吸附试验（ELISA）：检测血清中AFP和AFP-L3水平。
肿瘤增殖、脾脏和肝脏指数：计算肿瘤体积、负荷、数量、平均直径/体积，以及脾脏指数和肝脏指数。
苏木精-伊红（H&E）染色：观察肝脏组织形态。
免疫组织化学（IHC）：检测肝脏组织中NSUN2和PKM2的蛋白表达。
RNA分离与实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）：评估NSUN2、NSUN6、PKM2的mRNA表达水平。
蛋白质印迹法（Western Blotting）：检测NSUN2、HK2和乳酸脱氢酶A（LDHA）的蛋白表达水平。
靶向代谢组学：采用超高效液相色谱系统结合质谱分析，量化肝脏组织中糖酵解相关代谢产物的含量。
统计分析：使用SPSS和GraphPad Prism软件进行数据分析。
结果
艾灸和电针减轻HCC小鼠肝损伤并预防肝肿瘤发展
肉眼观察显示，模型组小鼠肝脏表面粗糙不平，有许多大小不一的颗粒状圆形突起，局部有白色或暗红色肿瘤，肿瘤遍布血管。与模型组相比，艾灸组和电针组的肝脏肿瘤数量、肿瘤负荷、肿瘤平均直径和平均体积均显著减小，且血管较少。
H&E染色显示，模型组肝索和肝窦结构破坏，中央静脉移位，肿瘤边界不清，伴有严重的肝细胞空泡化和广泛的炎症细胞浸润。艾灸组和电针组基本保留了正常的肝脏结构，尽管部分细胞质可见小空泡，并观察到坏死和再生肝细胞簇。
模型组小鼠的脾脏指数和肝脏指数显著高于正常组，艾灸后脾脏指数显著下降。同时，模型组血清AFP和AFP-L3含量显著高于正常组，而艾灸和电针干预后两者含量均显著降低。这些结果表明，艾灸和电针可以降低小鼠脾脏指数，抑制AFP和AFP-L3的表达，从而在HCC进展过程中延缓肿瘤增殖。
艾灸和电针抑制HCC小鼠中的NSUN2和酶PKM2
免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组NSUN2和PKM2蛋白表达显著升高。与模型组相比，艾灸组和电针组中NSUN2和PKM2的表达降低。
qRT-PCR结果显示，模型组NSUN2和PKM2的mRNA表达升高，而艾灸和电针干预后其表达下降。然而，NSUN6的mRNA水平无统计学差异。
艾灸和电针通过抑制糖酵解阻止HCC小鼠的疾病进展
质控标准显示代谢物具有良好的色谱分离效果。所有样本等量混合制备质控（QC）样本，其相对标准偏差（RSD）小于30%，表明数据稳定可靠。
热图显示了正常组与模型组、模型组与电针组、模型组与艾灸组之间肝脏糖酵解相关代谢产物的差异。
对肝脏组织中糖酵解相关代谢产物的分析显示，与正常组相比，模型组中G6P、F6P、鸟苷-5‘-单磷酸（GMP）和腺苷一磷酸（AMP）的相对含量显著增加，而3-磷酸-D-甘油酸（3PG）和PEP的相对含量降低。与模型组相比，艾灸和电针干预后，G6P和AMP的相对含量下降，而PEP含量升高。同时，艾灸还能额外降低F6P和GMP的相对含量。
艾灸和电针通过抑制NSUN2介导的糖酵解阻止HCC小鼠的发展
蛋白质印迹分析结果显示，模型组中NSUN2和HK2的蛋白表达显著增加，而艾灸和电针干预后其表达下降。
然而，LDHA的蛋白水平无统计学差异。
讨论
由于缺乏高特异性和敏感性的早期诊断生物标志物，加上HCC固有的高转移潜能，其患者总体生存率仍然极低。HCC是炎症驱动癌变的典型例子。本研究使用的DEN联合CCl4诱导的小鼠模型，再现了肝脏中炎症向癌症的转变，是HCC研究的经典模型。
HCC的治疗选择多样且取决于分期。近年来，针灸和艾灸常与其他疗法结合用于治疗HCC，在抑制肿瘤生长、减轻不良反应、缓解临床症状、提高生活质量和延长生存期方面显示出优势。作为补充和替代疗法，针灸和艾灸在HCC中显示出双重临床益处：增强镇痛和减少药物副作用，同时通过免疫调节发挥抗肿瘤作用。
从中医理论看，肝癌的发展与肝脾肾虚、气滞湿热瘀毒有关。“足三里”（ST36）是足阳明胃经的合穴和胃的下合穴，是健脾要穴。“肝俞”（BL18）是基于“脏病取背俞”的治疗原则。研究表明，针刺“足三里”可抑制H22肝癌小鼠的肿瘤细胞生长。艾灸“肝俞”和“足三里”可通过调节Wnt信号通路有效减少癌细胞增殖。
脾脏指数是机体免疫状态的重要指标。本研究中治疗后脾脏指数的降低表明，电针和艾灸可能改善脾脏功能并调节全身免疫反应，这可能与其观察到的抗肿瘤作用有关。同时，干预后肝叶粘连程度、肝脏指数显著降低，肝脏肿瘤数量、负荷、平均直径和体积均小于模型组，这表明艾灸和电针可以抑制HCC肿瘤的生长。
AFP是HCC监测和诊断中最常见的血清检测方法，但其诊断敏感性较低。因此，AFP通常与其他血清生物标志物联合使用。AFP-L3可以提高HCC诊断的特异性，是新一代HCC诊断标志物。本研究显示，模型组血清AFP和AFP-L3蛋白含量显著高于正常组，而艾灸和电针治疗后两种蛋白含量显著低于模型组，这表明艾灸和电针均改善了HCC小鼠的肝功能。
研究表明，NSUN2敲除可抑制HCC的细胞过程和肿瘤生长。本研究发现，与模型组相比，艾灸和电针干预后肝脏组织中NSUN2的蛋白和mRNA水平显著降低。这表明艾灸和电针干预可能通过抑制NSUN2的表达来影响HCC的发展。
癌症由代谢异质性的细胞组成。葡萄糖代谢是生命活动的主要能量来源，在癌症发展中起着关键作用。即使在氧气充足的情况下，癌细胞也优先利用糖酵解途径并产生乳酸，这种现象被称为“瓦博格效应”（Warburg Effect）。HK2是葡萄糖进入细胞后参与葡萄糖代谢的第一个限速酶，在HCC组织中高表达。PFK1参与催化G6P转化为F6P并随后转化为果糖-1,6-二磷酸的过程。PKM2是糖酵解途径的末端酶，在HCC中上调并与不良预后相关，它通过催化PEP和ADP转化为丙酮酸和ATP来增强瓦博格效应，促进HCC的发生和转移。
本研究利用靶向代谢组学分析组间糖酵解代谢物的差异，发现G6P、F6P和PEP存在显著变化。与正常组相比，模型组肝脏组织中G6P和F6P的相对水平升高，而艾灸降低了G6P和F6P的水平，电针降低了G6P水平。这些发现表明，艾灸和电针可能增加葡萄糖摄取，导致G6P和F6P水平降低。在模型组中观察到PEP水平下降，PKM2蛋白和mRNA表达升高，以及HK2蛋白表达升高。相比之下，艾灸和电针干预提高了PEP水平，同时降低了PKM2蛋白和mRNA表达以及HK2蛋白表达。总之，这些结果表明，艾灸和电针可能抑制糖酵解末端酶PKM2，从而减少PEP消耗，影响乳酸产生，最终抑制HCC中的糖酵解过程。
尽管电针和艾灸作用于相同的穴位，但它们通过不同的初始信号机制影响HCC进展。本研究发现，两种干预措施都汇聚于抑制NSUN2-PKM2糖酵解轴，表明在抑制HCC方面，它们可能共享一个共同的下游代谢调控节点。然而，对每种干预措施改变的代谢谱进行更深入的分析发现，艾灸表现出更广泛的代谢调节能力，影响了包括G6P、F6P、PEP、GMP和AMP在内的一系列代谢物。这表明艾灸可能诱导更全面的代谢重编程和能量应激反应。而电针对F6P和GMP的调节没有显示出明显效果，表明其对代谢网络的影响可能更为集中，但仍足以有效抑制核心通路。未来研究需要进一步阐明这两种模式之间的具体机制差异。
本研究存在一些局限性。机制结论主要依赖于艾灸/电针与NSUN2/PKM2水平降低之间的相关性观察，缺乏直接的功能验证。缺乏假针刺对照组使得区分特异性治疗效果与非特异性生理反应变得复杂。未来的研究应纳入遗传或药理学干预、严格的控制组和临床研究，以加强这些发现的机制和治疗意义。
关于与当前疗法结合的未来方向。虽然经动脉化疗栓塞（TACE）和免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为中晚期HCC的关键治疗方法，但其临床应用受到已知限制的制约。TACE后的缺血缺氧可能加剧肿瘤微环境内的免疫抑制，并可能引发“反弹侵袭”生长模式，而ICIs的疗效常因HCC中的治疗相关不良事件而受限。本研究揭示的机制表明，针灸可以干预TACE后残余肿瘤细胞的代谢重编程，为抑制侵袭性进展提供了理论基础，并展示了其免疫调节潜力。未来的研究应侧重于评估针灸联合TACE对客观缓解率、无进展生存期和生活质量的影响，以及考察针灸联合免疫疗法对肿瘤免疫微环境、治疗反应率和不良事件特征的影响。通过推进基于机制的临床研究，针灸和艾灸有望成为HCC多学科管理中一个有价值的整合组成部分。
结论
总之，这些发现阐明，尽管电针和艾灸具有不同的生物物理性质，但它们都通过抑制NSUN2介导的糖酵解来抑制HCC的发生和进展，其中艾灸可能诱导更广泛的代谢应激反应。这些发现不仅为观察到的针灸对癌症患者（如改善生活质量和症状控制）的临床益处提供了机制基础，而且为潜在的联合治疗照亮了转化桥梁。虽然提供的相关性证据有力地支持了这一机制，但要确定因果关系，未来仍需通过拯救实验进行功能验证。用针灸靶向NSUN2-PKM2代谢-表观遗传节点，可能提供一种新的辅助策略，以增强当前标准HCC治疗的疗效或减少其副作用，值得进一步的临床研究。
伦理声明
本研究使用动物的方案经上海中医药大学动物伦理委员会批准。
作者贡献
所有作者均对报告的工作做出了重大贡献。
利益披露
作者报告在本工作中无利益冲突。
数据共享声明
支持本文结论的数据集可由通讯作者提供。
