Jenna Thibodeau|Jianlei Zhao|Holly Edwards|Lisa Polin|Juiwanna Kushner|Sijana H Dzinic|Kathryn White|Kian Hershberger|Yongwei Su|Tasnim Arroum|Lucynda Pham|Lauren Pavelich|Raina Awdish|Jacob LaValley|Austin C. Boucher|Wei Chen|Jing Li|Xun Bao|Maik Hüttemann|Jessica B. Back|Yubin Ge
美国密歇根州底特律韦恩州立大学医学院癌症生物学研究生项目
摘要
根据世界卫生组织2016年的分类标准，与唐氏综合征（Down syndrome, DS）相关的髓系白血病（Myeloid leukemia associated with DS, ML-DS）包括急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML）和患有DS的儿童的髓系增生异常（Myelodysplasia）。尽管ML-DS患者对基于阿糖胞苷（Cytarabine, Ara-C）的化疗具有高度敏感性，总体生存率优于非DS AML患者，但复发/难治性病例的预后较差。这凸显了理解Ara-C耐药机制并开发有效疗法的必要性。21号染色体上的cystathionine-β-synthase（CBS）基因在ML-DS细胞中显著过表达。CBS的过表达导致硫化氢（H2S）生成增加，从而降低复合体IV（Complex IV）的活性和氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation, OXPHOS）过程。研究表明，OXPHOS在非DS AML的Ara-C耐药性中起着重要作用。因此，在本研究中，我们探讨了CBS作为OXPHOS和Ara-C反应调节因子的作用。我们发现，对Ara-C耐药的ML-DS细胞中CBS的活性较低。在Ara-C耐药的ML-DS细胞系中过表达CBS会导致H2S增加和Ara-C敏感性提高，同时复合体IV的活性和OXPHOS均降低。而在对Ara-C敏感的ML-DS细胞系中敲低CBS则会增加OXPHOS和Ara-C耐药性。然而，复合体IV的活性降低，而H2S的生成没有变化，这表明CBS通过依赖H2S的机制和非依赖H2S的机制来调节OXPHOS。进一步的研究表明，使用ONC213靶向OXPHOS，以及使用venetoclax诱导细胞凋亡，可以在Ara-C耐药的ML-DS细胞中产生协同的细胞死亡效应。本研究确定了CBS作为OXPHOS和Ara-C反应调节因子的作用，而ONC213与venetoclax的联合使用为复发/难治性ML-DS患者提供了一种有前景的治疗方案，有助于改善其预后。
引言
根据世界卫生组织2016年的分类标准，患有唐氏综合征的儿童的急性髓系白血病（AML）和髓系增生异常统称为与DS相关的髓系白血病（ML-DS）。尽管DS患儿患AML的风险显著增加，但仅使用基于阿糖胞苷（Ara-C）的方案治疗时，他们的无事件生存率（Event-free survival, EFS）较高。[1],[2],[3]儿童肿瘤学组临床试验AAML0431显示，接受高剂量Ara-C诱导治疗的ML-DS患者的EFS率为89.9%，OS率为93.0%。[4]多项临床试验证明Ara-C是ML-DS治疗的基石。[4],[5],[6]阿糖胞苷被细胞摄取并磷酸化后，会整合到DNA中，导致快速分裂细胞的链终止和凋亡。尽管临床效果显著，但ML-DS的复发往往与Ara-C耐药性有关。约7-10%的ML-DS病例对治疗具有耐药性，或在缓解后9个月内复发。[4],[7]复发的ML-DS患者预后极差，OS率仅为34%（低于非DS患者），即使采用了包括干细胞移植在内的挽救疗法也是如此。[7],[8],[9]进一步研究Ara-C耐药机制对于开发新的靶向疗法以延长生存期或为复发/难治性ML-DS患者提供干细胞移植的机会至关重要。唐氏综合征的一个独特特征是21号染色体上基因的过表达，其中包括cystathionine β-synthase（CBS），该基因编码转硫化途径中的关键酶。[10]CBS主要催化同型半胱氨酸（Homocysteine）转化为半胱硫氨酸（Cystathionine）和硫化氢（H2S）。[11],[12]在基础水平下，H2S是一种重要的信号气体传递物质，参与多种生理过程。[13>由于21三体综合征，CBS的过表达会扰乱同型半胱氨酸代谢，导致H2S积累。[14]H2S会对细胞色素c氧化酶（Complex IV）的活性产生可逆的抑制作用，而Complex IV是电子传递链的关键组成部分，负责将电子传递给氧气并驱动ATP的产生。[15]这种干扰对氧化磷酸化（OXPHOS）有显著影响，[16],[17]这是非DS AML中Ara-C耐药性的一个已知因素。[18]我们之前的研究已经表明，与非DS AML相比，ML-DS中的CBS表达量增加，导致对Ara-C的敏感性增强。[19]基于这些发现，我们假设ML-DS中CBS的过表达会导致代谢脆弱性，从而增加对Ara-C的敏感性；相反，对Ara-C耐药的细胞会失去CBS，导致H2S减少，进而增加OXPHOS，这是Ara-C耐药性的标志。
在本研究中，我们探讨了CBS在调节ML-DS细胞中OXPHOS和Ara-C反应中的作用。此外，我们还试图评估在体外和体内条件下，通过药理学手段靶向OXPHOS是否能够对抗Ara-C耐药的ML-DS细胞。最终，这项工作可能为识别耐药ML-DS的脆弱性并提供改进治疗策略的新见解。
药物
阿糖胞苷（Ara-C）购自AbMole（美国德克萨斯州休斯顿）。Palm-O-Ara-C（NSC135962，一种适合体内小鼠研究的缓释剂型[20]）由韦恩州立大学（WSU；美国密歇根州底特律）的Karmanos癌症研究所（KCI）的动物模型与治疗评估核心（AMTEC）提供。Venetoclax（VEN）和IACS-010759购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。ONC213由Chimerix, Inc.（美国北卡罗来纳州达勒姆）提供。AZD5991和GYY4137也由该公司提供。
耐药ML-DS细胞中的CBS表达降低
为了检测化疗耐药的ML-DS细胞中CBS是否减少，我们使用了三种不同的细胞系：CMK和CMY对Ara-C分别具有敏感性和耐药性（IC50分别为0.139 µM和3.272 µM），而CMK/Ara-C-R细胞获得了Ara-C耐药性（IC50为366.3 µM，见图1A）。Western blot检测显示，无论是否添加Ara-C培养至少72小时，CMY和CMK/Ara-C-R细胞中的CBS水平均显著低于亲本CMK细胞（见图1B和C）。
讨论
虽然复发/难治性ML-DS病例较为罕见，但它们带来了重大的临床挑战。本研究揭示了CBS丢失在促进OXPHOS增加和Ara-C耐药性中的作用。我们的发现强调了识别复发/难治性ML-DS脆弱性的重要性，并突出了ONC213和VEN联合使用的治疗潜力。
CBS的过表达在癌症研究中主要被研究其与代谢的关系
CRediT作者贡献声明
Jenna Thibodeau：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。
Jianlei Zhao：撰写、审稿与编辑、数据可视化、验证、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。
Holly Edwards：撰写、审稿与编辑、数据可视化、资源协调、方法学设计、实验实施、数据分析。
Lisa Polin：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调、方法学设计、实验实施、数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）R21资助（项目编号1R21CA270718-01A1和1R01CA290480-01）以及Ring Screw Textron儿科癌症研究捐赠教席的支持。此外，Blood Cancer United专项研究中心（SCOR 7039-25）也提供了支持。Karmanos癌症研究所的动物模型与治疗评估核心、显微镜与成像细胞术资源核心、药理学与代谢组学核心部分得到了NIH的资助。
