基于重组丝蛛蛋白混合策略构建高性能复合蚕丝纤维的创新研究

为解决传统重组丝蛛蛋白纤维性能单一和嵌合蛋白设计复杂的问题，研究人员探究了将不同的重组吡咯状和指环状丝蛛蛋白直接混合，通过湿法纺丝制备复合纤维的策略。研究表明，尽管混合前未检测到蛋白质间直接相互作用，但Py2+W2混合物能形成均匀纺丝液并成功纺出纤维。通过后纺拉伸可调控纤维机械性能，部分性能可与嵌合蛋白Py2W2纤维相媲美。这项研究为定制高性能复合生物材料提供了一种灵活、简化的新路径。

蜘蛛丝是大自然创造的工程奇迹，这种由蛋白质构成的生物材料不仅具备超凡的强度和韧性，还拥有良好的生物相容性和可降解性，性能常常超越许多人造材料。圆网蜘蛛能生产多达七种不同类型的丝，每种都由独特的丝蛛蛋白构成，这些天然丝本身就是复合材料。然而，由于蜘蛛具有同类相食的特性且难以大规模、稳定地收集天然蛛丝，科学家们转向利用重组DNA技术来生产人工丝蛛蛋白。过去，相关研究多集中于单一或嵌合（将不同蛋白序列融合成一个分子）的丝蛛蛋白，而对于将不同种类的丝蛛蛋白简单物理混合后纺丝，探索其是否能形成性能优异的复合纤维，研究却十分有限。

为了填补这一空白，并探索一条更简单、灵活的复合材料开发路径，来自加拿大达尔豪斯大学的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了一项创新研究。他们受到自然界中胶原蛋白与弹性蛋白、蚕丝中丝素蛋白与丝胶蛋白等成功复合体系的启发，尝试将两种功能不同的重组丝蛛蛋白——源于附着盘丝的吡咯状丝蛋白（Py）和源于包裹丝的指环状丝蛋白（W）——在纺丝前直接混合，制备复合纤维。他们想要探究的是：这种简单的“鸡尾酒”式混合，能否绕过复杂的基因工程融合步骤，创造出性能增强的新型丝纤维？更重要的是，这两种蛋白在混合和纺丝过程中，究竟是如何相互作用的？

为了回答这些问题，研究团队运用了几个关键的技术方法。他们首先在大肠杆菌中表达了基于吡咯状和指环状丝蛋白重复单元的重组蛋白，包括单重复单元（Py₁, W₁）和串联重复单元（Py₂, W₂），并通过镍柱亲和层析进行纯化。随后，将纯化后的蛋白质以特定质量比溶解于三氟乙酸/三氟乙醇/水的混合溶剂中，配制纺丝液。关键的纤维成型过程采用了自动化湿法纺丝技术，将纺丝液挤入乙醇/水凝固浴中形成初生纤维，并进一步对纤维进行空气或水中的后纺拉伸处理。在表征方面，研究综合运用了动态光散射分析纺丝液中纳米颗粒的自组装；通过圆二色光谱、下拉实验和异核相关核磁共振波谱检测溶液中蛋白质间的相互作用；利用扫描电子显微镜和光学显微镜观察纤维形貌；通过傅里叶变换红外光谱显微技术分析纤维的二级结构组成；并利用自制装置进行单纤维拉伸测试，以全面评估复合纤维的机械性能。

研究结果

3.1. 重组蛋白生产和纺丝液制备

研究人员成功表达了Py₁、W₁、Py₂和W₂等重组蛋白，并利用与之前嵌合蛋白Py₂W₂相同的TFA/TFE/H₂O溶剂体系，将Py₁与W₁或Py₂与W₂以1：1质量比混合，成功配制出总蛋白浓度达20%的均匀纺丝液。

3.2. 复合纤维的纺丝、形态学和力学性能

Py₁+ W₁混合物能够形成初生纤维，但无法承受后纺拉伸。相比之下，Py₂+ W₂的混合物无论是等质量还是等摩尔混合，都能顺利通过湿法纺丝形成连续纤维，并能耐受不同条件的后纺拉伸（空气中2倍或4倍拉伸，水中2倍拉伸）。2 + W₂fibers wet-spun using an equimass mixture of the spidroins and collected in the as-spun (AS) state or following post-spin stretching in either air or water at the indicated draw ratio. Freeze fracture of fibers was employed to enable cross-sectional SEM imaging (bottom row).">扫描电镜分析显示，纤维具有由更细纤维平行组装而成的分层结构，且后纺拉伸会压缩并平滑纤维表面特征。力学测试表明，Py₂+ W₂复合纤维的机械性能可以通过后纺拉伸进行调节，但同时也表现出显著的变异性。例如，对于等质量混合的纤维，其性能可大致分为两个群体：群体1（高延展性，>100%）和群体2（低延展性，一般<100%）。2 + W₂fibers, wet-spun using an equimass mixture of the spidroins under specified conditions, with colour-coding by fiber diameter. For AS and air-stretched fibers, less extensible fibers (population 2) are shown to the right of the stress-strain curves with pooled population 1 and population 2 data.">在最佳情况下，空气中2倍拉伸的纤维延展性可达约220%，而空气中4倍拉伸的纤维强度可达约99 MPa。然而，水中拉伸的纤维则普遍表现出很低的延展性（约6.8%）。2 + W₂fibers wet-spun using an equimass mixture of the spidroins and collected in the as-spun (AS) state or following post-spin stretching in indicated condition at indicated draw ratio based upon the stress-strain curves in Fig. 2. Individual measurements are indicated with red dots, bar heights are averages, and error bars are the standard deviation. Data sets, excluding 2 × −water which was universally low in extensibility, were subdivided into two populations on the basis of extensibility, as indicated. Mechanical properties are tabulated in Table S1.">

3.3. 纤维状态二级结构分析

通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱显微技术分析发现，所有类型的Py₂+ W₂复合纤维中都含有显著的β-折叠结构，含量在~20%到~45%之间。2 + W₂fibers wet-spun from equimass mixture of the spidroins under specified conditions obtained from attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectromicroscopy. Each spectrum represents the average of three measurements from the same fiber. Deconvolution resulted in the fitted peaks (dotted lines) corresponding to secondary structures.">β-折叠含量通常与纤维强度呈正相关趋势。机械性能的变异性也在二级结构组成中得到了反映，力学性能更一致的纤维（如2×-空气拉伸），其二级结构也更为一致。

3.4. 测试丝蛛蛋白类型间的分子间相互作用

研究人员采用多种手段检测了Py和W单元在溶液状态下是否存在直接的相互作用。下拉实验显示，在缓冲液中，带有His₆标签的Py₂和未标签的W₂混合后，W₂不与镍柱结合，表明两者无相互作用。2+-affinity bead pull-down assay (labels – L: molecular weight ladder (annotated by mass in kDa); unbound: wash solution; bound: eluent from beads; load: solution applied to beads) where Py₂has a His₆-tag and W₂does not. b) Overlay of ¹H¹⁵N HSQC NMR spectroscopy experiments (black contours: [U¹⁵N]-Py₁; red contours (overlaid): [U¹⁵N]-Py₁with unlabelled-W₁at 1-to-2 M ratio of Py₁-to-W₁). For HSQC spectral display, the number of levels used for contouring was decreased for the mixture relative to the apo protein to allow visualization of both sets of contours.">异核单量子相干核磁共振波谱分析也表明，即使在高浓度下，Py₁的化学位移也未因W₁的存在而发生扰动。圆二色光谱分析显示，在纺丝液状态下，Py₂和W₂混合物的光谱仅仅是各自光谱的叠加平均，2 and W₂in spin dope solvent. a) Overlay of far-UV CD spectra of Py₂, W_2,and an equimass mixture of Py₂ + W₂in a dope solution (TFA/TFE/H₂O: 8/1/1 (v/v/v); 1% (w/v) for individual proteins or 2% (w/v) for the mixture). b) Hand-drawing of fiber from equimass mixture of Py₂ + W₂in TFA/TFE-d₃/H₂O: 3/1/1 (v/v/v) at 10% (w/v) total spidroin concentration. c) Overlay of ¹H¹⁵N HSQC experiments acquired in a dope solution (TFA/TFE-d₃/H₂O: 3/1/1 (v/v/v); black contours: [selectively-¹⁵N -unlabeled]-W₂at 5% (w/v); blue contours (overlaid): [selectively-¹⁵N-unlabeled]-W₂(5% (w/v)) with unlabelled-Py₂(5% w/v)); red boxed inset: peak observed at lower ¹H frequency than solvent, with full spectra for each condition shown in Fig. S9.">进一步证实了在纺丝前两种蛋白之间没有可检测到的直接相互作用。然而，动态光散射分析发现，Py₂和W₂的等质量混合物在纺丝液中能自组装成相对均一的纳米颗粒（直径约90 nm），而这种均一性在单个蛋白的纺丝液中较差，这可能意味着两者在纺丝液状态下发生了某种“共组装”。

研究结论与讨论

本研究成功验证了通过直接混合不同重组丝蛛蛋白来制备复合纤维的策略是可行且灵活的。尽管在纺丝前的溶液状态下，吡咯状和指环状丝蛋白的重复单元之间没有检测到直接的相互作用，但Py₂和W₂的混合物能形成相对均一的纺丝液，并顺利通过湿法纺丝形成纤维。关键在于，这些复合纤维的机械性能可以通过后纺拉伸进行调控，在部分条件下（如空气中2倍拉伸），其延展性等性能甚至能与之前报道的嵌合蛋白Py₂W₂纤维相媲美。然而，复合纤维也普遍表现出较大的机械性能变异性，这种变异性与其二级结构组成的差异相呼应，提示蛋白质在纤维中可能存在混合不均的情况。

这一发现具有重要的科学意义。首先，它表明有利于纤维形成的蛋白质间相互作用，主要是在湿法纺丝过程中（如在挤出针头时受到的剪切力或凝固浴中的去溶剂化作用下）被诱导产生的，而非在纺丝前的溶液状态下预先形成的。其次，尽管存在性能波动，但混合策略的成功为快速筛选不同蛋白质组合、开发具有目标力学性能的复合材料提供了一个更简单直接的平台。这可以作为设计更复杂嵌合蛋白或有针对性优化纺丝工艺的前期探索步骤。最后，这种复合纤维在变性水溶液中能快速重新溶解的特性，也暗示了其在可生物降解、甚至可回收再利用的生物材料领域的应用潜力。

总之，Anupama Ghimire、Jan K. Rainey等人的这项工作，为超越传统的单一或嵌合蛋白策略，开发高性能、功能可定制的重组丝蛋白基生物材料开辟了一条新颖且实用的途径。它强调了简单物理混合与复杂纺丝工艺相结合所能带来的可能性，为未来设计下一代智能生物材料提供了新的思路。