乳铁蛋白（LF）是一种非血红素铁结合糖蛋白，广泛存在于哺乳动物的外分泌液中（如牛奶、唾液和眼泪），也储存在中性粒细胞颗粒中，具有抗菌和抗炎作用，并能调节铁离子的吸收（Zhengyu Hu, 2025）。它属于转铁蛋白家族，分子量约为80 kDa（Bolesławska, Bolesławska-Król, Jakubowski, Przysławski, & Drzymała-Czyż, 2025）。LF由一条多肽链折叠成两个同源的叶状结构（N叶和C叶），每个叶状结构包含一个铁结合位点（Rodwal, Shinwari, Naizi, Sherzad, & Gopi, 2024）。LF具有多种生物功能：它可以螯合游离铁从而抑制病原微生物的增殖，直接裂解细菌细胞膜（依赖阳离子结构域），并抑制生物膜的形成（Uriel A Angulo-Zamudio, 2025）。它还可以阻止病毒附着在宿主细胞上并破坏真菌细胞膜（Gruden & Poklar Ulrih, 2021a）。LF主要从天然来源中提取，如牛乳；离子交换色谱法是主要的纯化技术，通常还包括洗脱、超滤和冻干等步骤（Chen et al., 2022）。然而，由于其效率低、工艺流程复杂和成本过高，这种方法的广泛应用受到限制（Krolitzki, Schwaminger, Pagel, Ostertag, Hinrichs, & Berensmeier, 2022）。因此，利用微生物细胞工厂合成LF受到了广泛关注。
近年来，人们采用了多种策略在各种微生物中建立表达乳铁蛋白的细胞工厂。Choi等人通过优化密码子、启动子和发酵过程，在Pichia pastoris中实现了约99.8 mg/L的LF产量（Choi et al., 2008）。Ward等人将内源性GlaA信号肽与表达盒融合，以提高mRNA稳定性并促进蛋白质折叠和定位，并结合多轮菌株突变，实现了2 g/L的产量（Pauline P. Ward, 1995）。Lv等人通过双启动子调控、信号肽筛选和内质网-高尔基体运输优化，在P. pastoris中将LF的摇瓶产量提高到654.5 mg/L；进一步优化3升发酵罐中的甲醇诱导条件后，产量超过5.38 g/L（Lv et al., 2023）。然而，LF对微生物的细胞毒性导致异源表达不稳定。除了广谱抗菌活性外，LF还会杀死酵母细胞（Abad, Pemán, Pérez, Grasa, & Sánchez, 2024）。它还能诱导Candida的凋亡样死亡，导致线粒体损伤、细胞质中细胞色素c的释放以及核染色质的浓缩。此外，LF会破坏酵母细胞膜，其与两性霉素B的协同作用可增强对真菌的杀灭效果（Kenya E. Fernandes, 2020）。
丝状真菌对LF具有很高的耐受性（Kenya E. Fernandes, 2020），而A. niger是丝状真菌中最常用的蛋白质表达宿主之一。此外，A. niger在蛋白质分泌方面优于其他微生物物种。它能够分泌多种蛋白质，同时具备高效的折叠和翻译后修饰能力、低成本的培养要求以及易于诱导的特点（Madhavan et al., 2022）。这种出色的蛋白质分泌能力使A. niger成为生产内源性和重组酶的理想载体（Q. Li et al., 2022）。因此，人们投入了大量努力在A. niger中开发高效表达系统，以生产同源和异源蛋白质（C. Li, J. Zhou, G. Du, J. Chen, S. Takahashi, & S. Liu, 2020）。此外，已经为几种A. niger物种建立了成熟的工业发酵系统。然而，丝状真菌中异源蛋白质的生产仍远未达到最佳水平，仍有很大的改进和优化潜力（Dujuan Liu, 2023）。因此，克服异源蛋白质产量的瓶颈是一个关键挑战（Q. Wang, Zhong, & Xiao, 2020）。作为解决这一问题的案例研究，我们报告了在A. niger中针对性优化LF表达的方法，这对于其高效和可扩展的生产至关重要。
在本研究中，我们在A. niger中实现了人乳铁蛋白（HLF）的功能表达。通过综合筛选表达宿主、启动子和信号肽，提高了该菌株的蛋白质分泌能力，最终实现了3.78 μg/L的HLF产量。随后，与内源性高分泌蛋白葡糖淀粉酶（GlaA）融合显著增强了HLF的表达能力，测试融合蛋白的长度提高了LF表达的稳定性。此外，敲除蛋白酶显著减少了分泌后的HLF降解，多拷贝整合到基因组中提高了HLF的表达能力。同时，改变菌丝形态也提高了HLF的分泌能力。最终，通过优化分批发酵过程，HLF的产量达到了1027.1 mg/L。这些结果为未来在A. niger中异源表达HLF的研究提供了坚实的基础。
