引言
多酚氧化酶（Polyphenol oxidases, PPOs）是一类含铜酶，能够催化酚类底物氧化成醌类物质。在禾谷类作物中，PPOs不仅参与籽粒褐变，也在植物防御反应中发挥作用。在驯化过程中，多个独立的PPO突变被选择出来，在谷物品质和植物适应性之间形成了一种权衡。然而，以往关于水稻PPO的研究多集中于粳稻参考基因组（Oryza sativassp. japonicacv. Nipponbare），对于整个稻属中PPO基因的多样性、拷贝数变异和演化历史仍缺乏全面的认识。
材料与方法
研究人员从中国国家生物信息中心（CNCB）、Ensembl Plants、美国国家生物技术信息中心（NCBI）和水稻基因组注释计划（RGAP）等数据库获取了19个野生稻和2个栽培稻物种，以及3个近缘禾本科植物的全基因组数据。利用Nipponbare的PPO序列作为查询，通过tBLASTn程序系统性地鉴定了PPO基因。候选基因区域通过FGENESH+程序进行蛋白质和编码序列（CDS）预测，并辅以人工校正。使用MUSCLE算法进行多重序列比对，并通过PHYLIP软件包构建系统发育树。此外，还通过酚染色反应实验测定了不同稻种籽粒的PPO活性，并利用公开的RNA-seq数据分析了PPO基因的表达模式。
结果
Nipponbare基因组编码两个全长PPO和三个截短变体
分析确认，Nipponbare参考基因组中存在两个全长PPO基因：OsPPO1（Os04g53300）和OsPPO2（Os01g58100），以及四个截短的位点。其中，Os04g53260和Os04g53290很可能是一个被两个Ty3-gypsy类转座子插入而打断的单一基因位点。因此，Nipponbare中实际上存在三个截短的PPO变异体。
稻属包含三种不同的PPO类型，并形成两个基因组簇
通过对21个稻属物种及3个近缘物种的分析，发现二倍体物种含有3-5个PPO基因（包括全长和截短变体），而四倍体物种则含有7-11个。系统发育和蛋白质特征分析将PPO分为三个明确的支持良好的分支，命名为PPO1–PPO3，其中PPO1进一步分为PPO1-1和PPO1-2两个亚型。PPO1基因在染色体4上形成一个基因簇，而PPO2和PPO3基因则共定位于染色体1上。绝大多数被调查的物种中都发现了截短的PPO变异体。
PPO基因的出现和分布。展示了21个稻属物种和3个近缘禾本科物种的PPO基因清单。物种按进化关系排列。黑色箭头表示全长PPO位点；灰色箭头表示含有提前终止密码子或大片缺失的截短PPO位点；红色叉号表示无功能的PPO位点或缺乏必需结构域的位点。">
PPO1和PPO2通过串联复制在稻属中扩张，而PPO3没有
基因组定位分析显示，所有重复的PPO基因都组织在PPO1或PPO2/PPO3簇中，与其祖先基因相邻，表明稻属中PPO的扩张主要是通过串联复制发生的。具体而言，PPO1在具有AA、BB、CC、DD或EE基因组的物种中扩张，而PPO2在具有CC、JJ、KK、LL、FF、GG和HH基因组的物种中扩张。在所有检查的物种中均未观察到PPO3的重复。
PPO2缺乏类囊体转移结构域
多重序列比对显示，所有三种PPO类型的铜结合位点CuA和CuB以及C末端域（CTD）内的DWL和KFDV基序都高度保守。然而，PPO2的N末端域（NTD）与PPO1和PPO3不同。PPO1和PPO3的NTD同时含有叶绿体转运肽（cTP）和类囊体转移域（TTD），而PPO2仅含有cTP，完全缺少TTD。因此，PPO2缺乏Tat（双精氨酸转运）途径靶向所特有的双精氨酸（RR）和丙氨酸切割（AXA）基序。
PPO1-2和PPO2在各物种间显示出保守的突变位点，而PPO1-1和PPO3的突变是独立发生的
对截短PPO基因中插入缺失（indel）的分析揭示了两种模式：PPO1-1和PPO3中的突变位点在不同物种中独立产生，而PPO1-2和PPO2中的突变位点在物种间是保守的。PPO2和PPO1-2的保守突变表现出基因组特异性分布模式。
Nipponbare中的PPO1-2.1（Os04g53260/Os04g53290）代表一个被两个转座子打断的单一基因
通过比较Nipponbare与O. rufipogon、O. glumipatula、O. punctata和L. perrieri的PPO1基因簇所在的基因组区域，发现该基因簇在所有被检查的物种中都是同线的。三个稻属物种在相应位置都有一个未被转座子插入的PPO1-2.1位点，这支持了Nipponbare中两个截短的PPO位点Os04g53260和Os04g53290是由转座子介导的基因打断造成的结论。
在非洲栽培稻Oryza glaberrima中发现了一个新的截短PPO1-1等位基因
研究人员在栽培非洲稻O. glaberrima中发现了一个由外显子I中单碱基缺失引起的新的截短PPO1-1等位基因。对另外七个O. glaberrima栽培品种基因组的检查发现，其中三个也携带该等位基因。酚染色反应实验证实，携带该突变等位基因的O. glaberrima材料（IRGC 96717）的PPO活性呈阴性。
Oryza glaberrima中的一个新型PPO1-1突变等位基因及酚染色反应测定。(a) 在O. glaberrima中发现了一个新的PPO1-1突变等位基因。(b) PPO活性的酚染色反应测定。">
讨论
本研究表明，稻属中PPO基因的拷贝数具有高度动态性，基因复制进一步塑造了这种多样性。PPO1和PPO2在大多数稻属物种中经历了串联复制，这些事件与系统发育关系和基因组类型分类密切相关。基于PPO拷贝数模式，被检查的稻属物种可以大致分为三个对应的PPO扩张组。这些扩张模式在系统发育上的分布也揭示了基因家族在整个稻属中动态的演化轨迹，与已建立的稻属系统发育一致。
观察到的PPO扩张和丢失模式可能反映了在稻属演化过程中对环境压力变化的适应性响应。鉴于PPOs通过酚类氧化作用广泛参与植物对植食动物和病原体的防御，这些扩张事件可能与特定的高选择压力实例相关。分析表明，PPO2的扩张发生在稻属及其近缘禾本科植物Leersia perrieri的共同祖先中，但随后在GP1和BB基因组谱系中丢失。相比之下，PPO1随后在GP1和GP2物种的祖先中扩张，表明选择压力转向了生殖组织。
尽管PPO基因家族在稻属物种中扩张，但大多数基因组保留的全长拷贝少于五个，这反映了频繁的基因丢失。这种模式表明，维持多个功能性PPO拷贝可能没有优势甚至可能有害。然而，几乎所有稻属物种在PPO1和PPO2/PPO3簇中都至少保留了一个PPO基因，某些栽培稻材料除外。这种保守模式表明，尽管PPO突变体除了缺乏籽粒褐变外对营养生长没有明显影响，但基本的PPO活性对于稻属的适应性仍然至关重要。
研究结果符合多基因家族演化的“生死”模型，即连续的复制和谱系特异性假基因化事件塑造了基因家族的多样性。稻属中的PPO基因家族是这一动态过程的例证：串联复制以谱系特异性模式扩张了PPO1和PPO2，而频繁的截短则反映了持续的假基因化。含有提前终止密码子的截短PPO在稻属物种间表现出保守和独立的突变模式。
结果表明，PPO1-1和PPO3基因中的突变在不同谱系中独立产生，表明这些突变是在物种形成后起源的。PPO1-1突变在两种栽培稻物种——粳稻Nipponbare和非洲栽培稻O. glaberrima——中的存在，强有力地支持了这些等位基因与驯化的关联，因为功能丧失的PPO等位基因减少了酶促褐变并改善了谷物外观。相比之下，PPO3突变主要存在于野生稻物种中，表明是自然选择而非驯化驱动了PPO3的丢失。值得注意的是，在大多数稻属谱系中，PPO3截短与PPO2扩张表现出强相关性，这表明PPO2和PPO3之间存在功能冗余，PPO2的扩张可能降低了对维持PPO3的选择压力，最终导致其在几个谱系中退化或丢失。
