引言
眼底新生血管病（OFN）是导致不可逆性视力丧失的主要原因，涉及早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变（DR）和新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）等多种疾病。当前标准疗法，如反复玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（抗VEGF）药物和激光光凝，存在无法区分病理性与修复性血管生成、以及忽视衰老相关微环境驱动疾病进展等局限。近年研究表明，衰老内皮细胞（EC）构成了病理性血管的结构支架，而邻近的衰老小胶质细胞加剧了炎症信号，二者共同恶化富含活性氧（ROS）的血管-免疫微环境。衰老细胞清除（senolysis）疗法因此成为有前景的新兴策略。然而，前花青素C1（PCC1）等药物面临着体内快速清除、在ROS环境中易氧化降解以及病灶保留差等挑战。
PCC1/PHCF-Gel水凝胶的制备与表征
为克服上述挑战，研究者设计了一种可注射的ROS响应性衰老细胞清除水凝胶（PCC1/PHCF-Gel）。该体系通过苯硼酸修饰的透明质酸（PBAmHA）和壳聚糖（PBAmChi）与PCC1形成硼酸酯键交联网络，并引入泊洛沙姆F127（PF127）赋予其温敏特性。扫描电镜显示水凝胶具有多孔结构，平均孔径约为15 µm。流变学分析表明，PCC1/PHCF-Gel在30.71°C发生溶胶-凝胶转变，凝胶化时间仅为22秒，适合注射并在体内原位成型。该水凝胶在过氧化氢（H2O2）存在下降解加速，证明了其ROS响应性。细胞毒性实验证实其对正常人类视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）生物相容性良好。
体外衰老细胞清除效能
在体外，研究者建立了过氧化氢诱导的衰老HRMEC模型。CCK-8实验显示，PCC1/PHCF-Gel在75 µM浓度下可选择性降低衰老HRMEC的活力，而对正常增殖细胞影响甚微。衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、免疫荧光（检测γH2AX和p21表达）以及流式细胞术（Annexin V/PI双染）结果一致表明，PCC1/PHCF-Gel能剂量依赖性地诱导衰老HRMEC发生凋亡，其效果优于游离的PCC1，而空白水凝胶（PHCF-Gel）无此作用。
体内生物相容性、ROS响应性与长效性
在小鼠体内，玻璃体内注射PCC1/PHCF-Gel后，组织学检查显示其眼部及主要器官均未引起病理改变，血液生化及血常规指标正常，裂隙灯检查显示角膜和晶状体透明，证明了其良好的生物相容性。在氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，通过二氢乙锭（DHE）和2‘,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCF）染色，证实了视网膜内ROS水平在病理新生血管高峰期（P17）达到峰值。液相色谱-三重四极杆串联质谱（LC-QQQ-MS）分析显示，视网膜内PCC1浓度与ROS水平呈正相关，证实了水凝胶的ROS响应性释放行为。此外，活体荧光成像显示，与游离的Cy5标记PCC1相比，PCC1-Cy5@PHCF-Gel在玻璃体内的保留时间显著延长，在BALB/c小鼠中荧光信号可持续至少35天，证明了其长效递送能力。
PCC1/PHCF-Gel通过衰老细胞清除缓解OIR模型中的病理性视网膜血管生成
在OIR模型中，于P15（新生血管高峰期前）进行玻璃体内注射治疗。对视网膜铺片进行异凝集素B4（IB4）和SA-β-gal双染发现，病理性新生血管簇（NVT）和无血管区（AVA）边缘富含衰老细胞。与PBS对照组相比，PCC1/PHCF-Gel治疗能最显著地减少NVT和AVA面积，并降低SA-β-gal阳性区域。组织学定量分析也显示，PCC1/PHCF-Gel组视网膜前新生血管细胞核数量减少最多。全视野暗视视网膜电图（ERG）评估表明，PCC1/PHCF-Gel治疗能显著提升因缺血而降低的a波和b波振幅，表明其具有神经保护作用，能改善视网膜功能。
PCC1/PHCF-Gel通过凋亡实现对衰老EC和小胶质细胞的双靶点清除
基因集富集分析（GSEA）显示，与PBS处理的OIR视网膜相比，PCC1/PHCF-Gel处理组的衰老相关基因集（如Fridman_Senescence_UP）和衰老相关分泌表型（SASP）、肿瘤坏死因子（TNF）、核因子κB（NF-κB）信号通路均呈负向富集，表明治疗降低了衰老负担并抑制了炎症通路。免疫荧光共定位分析证实，在OIR视网膜的NVT中，存在大量共表达p16INK4a（或p21）与CD31（EC标志物）的衰老EC，以及共表达p16INK4a（或p21）与IBA1（小胶质细胞标志物）的衰老小胶质细胞。PCC1/PHCF-Gel治疗能显著减少这些共定位信号。进一步的TUNEL凋亡检测与免疫荧光共染发现，PCC1/PHCF-Gel能诱导CD31+TUNEL+的EC和IBA1+TUNEL+的小胶质细胞凋亡，且效果强于游离PCC1，明确了其通过凋亡介导衰老细胞清除的机制。
单细胞RNA测序鉴定出CXCR4+EC是PCC1/PHCF-Gel的优先靶点并提示血管修复增强
对P17 OIR视网膜进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，聚焦于内皮细胞。UMAP可视化显示，PBS组和PCC1/PHCF-Gel组的EC聚类分布存在差异。通过跨条件聚类匹配分析，发现PBS组中存在四个独特的EC簇（包括簇7），在PCC1/PHCF-Gel组中消失。点图分析显示，促凋亡蛋白NOXA（PMAIP1）和PUMA（BBC3）在PBS组的簇5、簇6和独特的簇7中高表达。基因集变异分析（GSVA）和内皮特异性通路分析表明，PBS独特的簇7与免疫炎症通路和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）介导的病理性眼新生血管通路正相关，而PCC1/PHCF-Gel组中与之匹配的簇则呈现相反的关联。衰老评分分析确认簇7具有最强的衰老特征。该簇的标志物之一是CXCR4。免疫荧光证实，CXCR4与p21在OIR模型的病理性新生血管病灶中共同定位，而在PCC1/PHCF-Gel治疗后几乎检测不到，在正常视网膜中也不存在，表明PCC1/PHCF-Gel选择性清除了病灶特异的CXCR4+p21+衰老EC亚群。
单细胞RNA测序揭示选择性清除IFITM3+小胶质细胞
对小胶质细胞的scRNA-seq分析发现，PBS组中存在一个独特的高衰老评分簇6，该簇的代表性标志物是IFITM3。免疫荧光证实，IFITM3与p21在OIR视网膜的病理性病灶中共定位，且该信号在PCC1/PHCF-Gel治疗后显著减弱。这表明PCC1/PHCF-Gel还能选择性清除与衰老相关的IFITM3+炎症性小胶质细胞亚群。
PCC1/PHCF-Gel通过衰老细胞清除抑制激光诱导的脉络膜新生血管
在模拟nAMD的激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型中评估PCC1/PHCF-Gel的疗效。于激光后第3天进行玻璃体内注射治疗。眼底荧光血管造影（FFA）显示，PCC1/PHCF-Gel在注射后第7天和第14天均能最有效地减少CNV渗漏面积，效果优于阿柏西普（aflibercept）或游离PCC1。组织学H&E染色定量分析也证实，PCC1/PHCF-Gel治疗组的CNV横截面积最小。ERG检测表明，PCC1/PHCF-Gel能最有效地恢复因CNV损伤而降低的scotopic a波和b波振幅。对脉络膜铺片进行免疫荧光染色发现，CNV病灶内有大量共表达CD31与p21（或p53）的衰老EC，而PCC1/PHCF-Gel治疗能显著减少这些衰老EC的数量。
结论
本研究成功构建了一种ROS响应性的PCC1/PHCF-Gel递送系统，实现了PCC1在眼底病灶的长效、靶向释放。该疗法通过凋亡机制选择性清除衰老EC和衰老小胶质细胞，打破了驱动新生血管进展的局部血管-炎症恶性循环。单细胞测序精准揭示了其清除的靶点：在健康视网膜中几乎不存在的CXCR4+衰老EC和IFITM3+衰老小胶质细胞。这种双靶点衰老细胞清除策略重塑了疾病微环境，促进了缺血视网膜的功能性血管修复和神经保护，在OIR和CNV两种动物模型中均显示出优于传统抗VEGF疗法的疗效。该研究为衰老细胞依赖性的眼底新生血管性疾病（如增殖性DR和nAMD）提供了一种具有临床转化潜力的创新治疗策略。
