1 引言
脊髓损伤（SCI）是一种高致残性创伤，其继发性损伤可导致神经元内活性氧（ROS）过度产生和脂质过氧化，从而增加神经元对铁死亡的敏感性，阻碍神经再生与功能恢复。铁死亡作为一种铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，在SCI后扮演了重要角色。其中，脂质过氧化产物的积累和ROS的过量产生是铁死亡的重要特征。脂滴（LD）作为中性脂质的储存细胞器，通过调节多不饱和脂肪酸（PUFA）和自由基的代谢参与铁死亡进程。研究表明，脂滴相关蛋白ApoL6可通过与Plin1直接相互作用抑制LD脂解。然而，SCI后神经元因能量供应不足，会加速脂肪酸分解，过高的脂肪酸氧化（FAO）可导致ROS水平升高和脂质过氧化，进而损害神经元。因此，阐明SCI后抑制神经元铁死亡的分子细胞机制至关重要。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）分析，发现转录因子CREB5在SCI后转录活性增强，并通过调控ApoL6表达影响神经元铁死亡，为SCI治疗提供了新思路。
2 材料与方法
研究采用了多种实验方法。首先，利用公开的scRNA-seq（GSE234774）和scATAC-seq（GSE230765）数据集进行分析，通过UMAP降维可视化聚类结果，并依据原始数据提供的细胞注释信息进行细胞类型鉴定。利用Seurat和Signac软件包处理scATAC-seq数据，从整合对象中分离神经元亚群，并通过UMAP降维可视化染色质可及性谱。从JASPAR2020数据库获取脊椎动物转录因子（TF）的位置频率矩阵，利用mm10参考基因组进行基序注释。通过FindMarkers识别差异可及性峰（DAP），并使用FindMotifs预测显著DAP中富集的TF基序。
研究使用8周龄C57BL/6J野生型小鼠，通过胸段（T10）脊髓挫伤或挤压伤建立SCI模型。分离培养原代皮层神经元和脊髓神经元，后者使用间接磁性标记系统去除胶质细胞等杂质以获取高纯度神经元。通过腺病毒（Adv）或腺相关病毒（AAV）感染实现CREB5的敲低（KD）或ApoL6的过表达。通过Basso小鼠量表（BMS）、转棒测试、von Frey细丝测试和后肢运动学分析评估小鼠神经功能恢复情况。
使用免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blot）、逆转录定量PCR（qPCR）检测相关蛋白和mRNA表达。采用活性氧（ROS）检测试剂盒和脂质过氧化产物检测试剂盒评估神经元氧化应激水平。通过脂解实验检测游离脂肪酸（FFA）和甘油释放，并使用Seahorse分析仪测定FAO速率。通过染色质免疫沉淀（ChIP）、定量ChIP（qChIP）和报告基因实验验证CREB5与ApoL6启动子的结合及其转录激活活性。利用轴突微流体装置评估神经元轴突生长，并通过碘化丙啶（PI）/钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）双染色观察神经元存活与死亡。数据以均值±标准差表示，采用GraphPad Prism进行统计学分析。
3 结果
3.1 scRNA-seq与scATAC-seq的降维与细胞类型注释
通过分析公开的scRNA-seq和scATAC-seq数据，对SCI后神经元进行降维、聚类和细胞类型注释。UMAP图展示了scRNA-seq检测到的所有细胞类型及神经元亚群分布，饼图显示了四类神经元的细胞比例。scATAC-seq数据的平行分析显示了与scRNA-seq一致的神经元亚型比例，相互验证了分析结果。
3.2 SCI后神经元中CREB5的表达与转录活性增强
通过分析神经元特异性DAP中富集的TF基序发现，在损伤后7天（7 dpi）和2个月（2 mpi），Creb5等基序在可及区域显著富集，且与上调的差异表达基因（DEG）密切相关。CREB5因其在急性和慢性期均持续富集，以及在神经元可塑性中的已知作用而被选为后续研究重点。值得注意的是，SCI后CREB5的表达呈现先升高后降低的双相趋势，该趋势在GSE234774数据集、qPCR和蛋白质印迹实验中均得到验证。结果表明，SCI后转录因子CREB5的表达增加，且其转录活性增强。
3.3 体外敲低CREB5损害轴突生长并加剧神经元死亡
在体外，利用氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理原代神经元并建立轴突微流体实验模型。结果显示，敲低CREB5显著抑制了神经元的轴突生长，并加剧了神经元死亡。相反，过表达CREB5则显著促进轴突生长并减轻神经元死亡。
3.4 敲低CREB5阻碍小鼠SCI后的功能恢复
通过构建靶向神经元CREB5敲低的腺相关病毒，在体实验证实，CREB5敲低阻碍了小鼠后肢功能恢复，这一结论通过BMS评分、转棒测试得到验证。此外，神经元CREB5敲低也阻碍了SCI后感觉功能的恢复。在损伤后28天，后肢运动学分析显示，CREB5敲低小鼠出现踝关节活动范围减小、步幅缩短、最大髂嵴高度降低和后肢关节摆动幅度减小等多种运动功能损伤。免疫荧光染色结果证实，CREB5敲低不利于神经元存活，并对5-HT+血清素能轴突的再生产生不利影响。这些结果表明，神经元CREB5敲低损害了小鼠SCI后的后肢功能恢复。
3.5 CREB5通过反式激活ApoL6转录促进其在SCI后的表达
通过整合scRNA-seq和scATAC_TSS窗口数据构建基因共表达网络，鉴定出ApoL6是CREB5潜在的转录调控靶点。基于JASPAR数据库的预测构建了ApoL6启动子突变体，荧光素酶报告实验显示，CREB5过表达显著增强了野生型ApoL6启动子的活性，而在Pro-MUT1突变体中这种激活作用不显著。ChIP实验证实了CREB5与神经元中ApoL6启动子区域的结合作用。qChIP实验结果显示，损伤后神经元中CREB5与ApoL6启动子的结合水平显著高于未损伤神经元。进一步研究表明，敲低神经元中的CREB5显著降低了ApoL6的mRNA和蛋白水平。值得注意的是，SCI后CREB5水平先升高后降低的变化趋势与ApoL6mRNA和蛋白水平的变化一致。这些发现表明，SCI后，CREB5通过增强对ApoL6的转录，最终上调ApoL6的表达。
3.6 CREB5通过促进ApoL6表达抑制SCI后神经元铁死亡
为确定CREB5对神经元死亡和轴突再生的影响是否通过调节ApoL6表达实现，研究通过腺病毒感染构建了CREB5敲低和ApoL6过表达的原代神经元。首先证实，CREB5敲低确实降低了SCI后神经元的LD水平。在使用异丙肾上腺素人工刺激脂解后，发现CREB5敲低显著增加了FFA和甘油含量，而补充ApoL6则减少了FFA和甘油的释放。Seahorse实验结果证实，CREB5敲低增强了神经元的FAO，而补充ApoL6逆转了这种效应。已知神经元对FAO高度敏感，过高的FAO会导致ROS水平升高和脂质过氧化，ROS检测和脂质过氧化物检测实验也验证了这一点。钙黄绿素AM/PI双染色和轴突微流体实验结果显示，CREB5敲低加剧了神经元死亡和轴突生长损伤，而过表达ApoL6可以消除这些不利影响。
在进一步研究中，使用OGD/R模型模拟SCI后神经元损伤。与之前结果一致，CREB5敲低后神经元FFA和甘油的释放显著增加，而补充ApoL6可抑制这种FFA和甘油释放的增加。Seahorse实验也证实，CREB5敲低上调了神经元的FAO，补充ApoL6消除了CREB5敲低的影响。此外，神经元铁死亡指标检测显示，CREB5敲低加剧了神经元铁死亡和轴突生长损伤，而过表达ApoL6可减轻CREB5敲低后神经元损伤造成的不利影响。使用磁性标记系统分离SCI后的原代神经元，结果与上述发现一致：SCI后敲低CREB5促进了LD释放FFA和甘油，增加了神经元的FAO，并加剧了神经元铁死亡和轴突生长损伤。值得注意的是，使用特异性铁死亡抑制剂Liproxstatin-1或Ferrostatin-1处理，可抑制神经元铁死亡，并防止CREB5敲低造成的损害。综上所述，研究证实CREB5可通过促进ApoL6的表达来抑制SCI后的神经元铁死亡。
3.7 CREB5通过增强ApoL6表达促进小鼠SCI后的功能恢复
为研究CREB5对小鼠SCI后功能恢复的影响是否通过促进ApoL6表达实现，研究构建了腺相关病毒以获得体内CREB5敲低小鼠及对照小鼠，随后注射AAV-Con或AAV-ApoL6。一系列功能实验表明，CREB5敲低显著阻碍了小鼠后肢功能恢复，而过表达ApoL6不仅部分促进了SCI后小鼠的后肢功能恢复，还部分抵消了CREB5敲低造成的不利影响。此外，CREB5敲低减少了小鼠后肢摆动幅度，缩小了踝关节和膝关节的活动范围，并降低了步幅和最大髂嵴高度。然而，损伤后异位过表达ApoL6使小鼠能够表现出行走运动、偶发的足底踏步、扩大的踝关节活动范围、增加的步长和改善的躯体支撑，同时也抵消了CREB5敲低造成的不利影响。
值得注意的是，免疫荧光结果证实，CREB5敲低增加了SCI后神经元死亡并阻碍了5-HT+血清素能轴突的再生，而异位表达ApoL6则促进了神经元存活和轴突再生。总之，研究发现SCI后，CREB5通过促进ApoL6的表达来减少神经元死亡并促进5-HT+血清素能轴突再生。
4 讨论
本研究确定了CREB5是抑制SCI后神经元铁死亡的关键靶点。具体而言，SCI后，CREB5通过增强对ApoL6的转录活性上调ApoL6的表达。ApoL6作为LD分解代谢的关键抑制因子，能有效抑制SCI后神经元过度ROS产生和脂质过氧化，从而降低神经元对铁死亡的敏感性。总之，CREB5/ApoL6轴并非广泛抑制铁死亡，而是通过精确调节神经元LD代谢以维持能量代谢稳态，建立了一个特定的调控级联（“脂质代谢平衡 → 铁死亡抑制”）。该级联反应促进了神经元存活和轴突再生，最终有利于功能恢复。因此，我们认为CREB5/ApoL6轴是SCI治疗中值得深入研究的靶点。
脂滴是一种动态细胞器，在神经元和胶质细胞中作为中性脂质的主要储存部位，在细胞代谢中扮演重要角色。LD不仅可以作为能量储备库，还可以通过酯化FFA来隔离有毒脂肪酸，最终防止细胞内脂质过氧化的发生。在SCI后神经元的氧化应激过程中，会发生脂质积累，LD的形成可以有效防止神经元脂质过氧化。本研究表明，SCI后ApoL6表达升高，通过抑制神经元异常的FFA和甘油释放，减少神经元过度的FAO，从而降低ROS产生。此外，它还能抑制有毒脂肪酸的释放，有效缓解脂质过氧化，最终通过减轻神经元铁死亡来促进功能恢复。因此，我们认为SCI后LD分解代谢和合成代谢的调控可能代表了神经元的一种自我保护机制，值得进一步深入研究。
转录因子CREB5的主要功能是通过结合特定DNA序列来调节基因转录。与CREB家族其他成员不同，CREB5缺乏保守的PKA调节磷酸化结构域，因此不能响应cAMP-PKA信号通路的激活。在神经领域，研究已证实其在调节小鼠胚胎发育期间的神经可塑性中的作用，其失调可能与致癌作用有关。值得注意的是，CREB5在代谢领域也扮演重要角色。本研究发现，SCI后CREB5表达上调，敲低CREB5会增加神经元铁死亡，限制损伤后小鼠的再生修复和功能恢复。进一步研究表明，SCI后，CREB5通过增强对脂解相关蛋白ApoL6的转录活性，抑制神经元脂质过氧化和过度ROS产生，并调节神经元LD的代谢平衡。这为抑制SCI后神经元铁死亡的研究提供了新的视角。然而，本研究存在局限性。SCI后调控CREB5表达的具体机制仍不清楚。例如，已有研究表明miR-206可下调CREB5并抑制肝细胞癌中PI3K/AKT信号通路的激活。此外，DNA甲基化也参与CREB5的调控。值得注意的是，组蛋白修饰也被报道可调节CREB5表达。因此，SCI后CREB5表达的调控可能涉及多重因素，我们认为这一方向值得深入研究。
5 结论
总之，本研究强调，SCI后神经元转录因子CREB5的转录活性和表达水平均升高，这有效上调了ApoL6的表达，从而限制LD分解，减少ROS和脂质过氧化的产生，并最终抑制神经元铁死亡。因此，CREB5有望成为抑制SCI后铁死亡的新潜在靶点。
