引言：记忆、生物钟与果蝇模型
动物通过学习形成记忆，新获得的记忆最初不稳定，但在特定条件下可通过巩固过程形成长时程记忆，并得以长期保存。果蝇因其丰富的遗传学工具和突变品系，成为揭示记忆分子机制的有力模型。其中，求偶条件反射是常用的记忆检测范式：处女雄蝇与已交配雌蝇配对后，雄蝇的求偶行为会受到抑制，这种抑制基于对雌蝇释放的厌恶刺激的记忆。1小时条件反射诱导的求偶抑制可持续8小时，被视为短时记忆；而7小时条件反射诱导的抑制可持续至少5天，被用于评估长时程记忆。
遗传学研究表明，条件反射后一天与两天的记忆所依赖的分子和细胞机制不同。因此，研究者将条件反射后至第一天的阶段概念上定义为LTM巩固期，第二天及之后定义为LTM维持期。众多研究发现，许多对巩固和维持求偶LTM必需的基因在蘑菇体（记忆的关键脑结构）中表达，但也有一些LTM基因在表达生物钟基因的时钟神经元中表达。这提示求偶LTM是由整合了蘑菇体和时钟神经元功能的复杂神经网络所协调的。
果蝇脑中约有240个时钟神经元，至少分为八个不同的簇，包括腹外侧神经元（s-LNvs和l-LNvs）、背外侧神经元（LNds）、后外侧神经元等。先前研究发现，LNds的一个亚群对于维持求偶LTM是必需的。此外，已知在昼夜节律行为中起作用的神经肽色素扩散因子，在LTM维持中也必不可少，且表达Pdf的神经元还可能释放Pdf以外的神经递质参与LTM巩固。然而，LNds和Pdf神经元在LTM加工中具体使用何种递质，此前尚不清楚。
结果1：LNds特异性敲低章鱼胺合成酶Tbh损害LTM维持
为了精确定位LNds中参与LTM的神经递质，研究者构建了仅在两对LNds中特异性表达split-GAL4的果蝇品系。利用该品系进行RNA干扰实验发现，特异性敲低LNds中章鱼胺合成通路的关键酶基因——酪胺β羟化酶（Tbh）或酪氨酸脱羧酶2（Tdc2），会显著损害条件反射5天后的LTM（即记忆维持）。然而，敲低乙酰胆碱合成酶基因ChAT则无明显影响。免疫荧光染色证实，Tdc2蛋白和Tbh-GFP融合蛋白在LNd-split-GAL4标记的这两对LNds中均有表达。这些结果表明，至少两对LNds通过章鱼胺能神经传递，对求偶LTM的维持起着关键作用。
重要的是，LNds特异性敲低Tbh对果蝇的睡眠总量、结构以及恒定黑暗条件下的昼夜节律行为影响甚微，说明这种记忆缺陷并非由睡眠或节律紊乱间接引起。
结果2：R78G02阳性细胞中章鱼胺参与LTM巩固与维持
研究者进一步利用表达范围更广的GAL4品系R78G02（其表达细胞包括三对LNds、一对第五s-LNv以及多个非时钟神经元）进行时空调控实验。使用温度敏感型GAL80系统（TARGET系统）在特定时间窗口敲低Tbh，发现无论是在记忆巩固期还是维持期抑制章鱼胺合成，都会损害LTM。通过免疫染色确认，R78G02阳性细胞中，包括LNds和第五s-LNv在内的时钟神经元均表达Tdc2和Tbh。然而，当使用另一个主要标记ITP阳性LNds和第五s-LNv的品系R54D11敲低Tbh时，却未观察到LTM损伤。综合这些结果推测，在R78G02阳性细胞中，LTM维持的损伤源于其中两对（非ITP阳性的）LNds章鱼胺合成的抑制；而观察到的LTM巩固缺陷，则可能源于R78G02阳性非时钟神经元的章鱼胺能信号传递。
结果3：Pdf神经元中章鱼胺合成专门调控LTM巩固
Pdf神经元（包括l-LNvs和s-LNvs）的神经传递已知为LTM巩固所必需。本研究发现，Tdc2蛋白主要存在于l-LNvs中，而Tbh-GFP在l-LNvs和s-LNvs中均有表达。在Pdf神经元中敲低Tdc2或Tbh，会导致LTM损伤。更为关键的是，利用TARGET系统在记忆巩固期（而非维持期）特异性敲低Pdf神经元中的Tbh，同样会破坏LTM。这表明，Pdf神经元的章鱼胺能信号传递特异性地参与了LTM的巩固过程。此外，敲低Pdf神经元中的Tbh对睡眠和昼夜节律影响不大，但敲低Tdc2则会导致节律失常，提示在Pdf神经元中，酪胺而非章鱼胺可能是调节昼夜节律的关键递质。
讨论：双重调节模型与神经环路启示
本研究首次明确揭示了章鱼胺在果蝇特定时钟神经元亚群中的双重记忆调节功能。总结而言，来自至少两对LNds的章鱼胺信号对于LTM的维持至关重要；而来自Pdf神经元（主要是l-LNvs）的章鱼胺信号则专门负责LTM的巩固。这一发现将时钟神经元从生物钟的“守时者”角色，拓展为记忆过程的“主动调节者”。
尽管蘑菇体被认为是LTM的核心脑区，但目前连接组学数据并未显示LNds或Pdf神经元与蘑菇体神经元之间存在直接投射。因此，章鱼胺信号很可能通过中间神经元间接调控蘑菇体的功能。未来的研究重点是鉴定接收这些章鱼胺信号的具体受体（如Oamb、OctβR等）及其所在神经元，从而绘制出连接时钟神经元与记忆中枢的完整神经环路图谱。
此外，环境光通过Pdf信号通路维持LTM，而LNd-split-GAL4标记的神经元恰好表达Pdf受体。一个有趣的待解问题是，光依赖的Pdf释放是否以及如何调控LNds的章鱼胺释放，从而将环境线索与记忆维持联系起来。
结论
该研究以果蝇为模型，精确定位了章鱼胺这一关键神经调质在生物钟神经网络中对于不同LTM时相的特异性调控作用。这不仅深化了对记忆形成与巩固机制的理解，也为探索更高等动物中生物钟与记忆交互作用的复杂神经网络提供了新的视角和实验基础。
