通过胶束电动毛细管色谱法测定外膜囊泡疫苗中残留的聚(N-乙酰神经氨酸)的浓度和粒径分布

本研究采用微囊化电动力学色谱（MEKC）结合负电荷多聚电解质多层涂层（SMIL）技术，高效分离并定量分析了 meningococcus 疫苗中残留的荚膜多糖（CapsPS），同时测定了外膜囊泡（OMV）的多分散指数和聚合度，为疫苗纯化工艺监控提供了新方法。

Laurent Leclercq|Jean-François Cotte|Jérôme Thiebaud|Jean Dubayle|Hervé Cottet

IBMM，蒙彼利埃大学，CNRS，ENSCM，蒙彼利埃，法国

摘要

背景

基于外膜囊泡（OMVs）的针对脑膜炎奈瑟菌的疫苗需要定量和表征在生产过程中未能完全去除的残留荚膜多糖（CapsPS）。由于CapsPS成分的复杂性以及样品中存在OMVs，这项任务具有挑战性。

结果

使用带负电荷的聚电解质多层涂层（SMIL）的胶束电动色谱法（MEKC）能够在大约40分钟内完全分离CapsPS和OMV残留物。使用4层SMIL涂层对于实现迁移时间的良好重复性（t_m）至关重要。该方法能够定量浓度在80至600 mg.L^-1之间的CapsPS。还确定了每批OMVs的平均聚合度和聚合度（DP_n），其多分散指数在1.2到1.5之间，聚合度（DP_n）在30到70之间。

意义

该方法可以很容易地应用于制药行业，用于监测和记录工艺开发过程。

引言

基于外膜囊泡（OMVs）的疫苗在免疫领域是一种有前景的方法，特别是针对细菌病原体。这些疫苗来源于革兰氏阴性细菌的外膜，含有多种能够刺激免疫系统的抗原[1]，[2]。OMVs在细菌生长过程中自然释放，并且可以通过各种纯化步骤进行修饰以改善其免疫原性[3]。OMVs是小型球形纳米颗粒，主要由细菌蛋白质、脂质和周质组成。对于脑膜炎奈瑟菌（Nm），目前的疫苗基于A、C、Y和W135等血清群的荚膜多糖[4]。Nm的荚膜多糖B免疫原性较差，这阻碍了基于荚膜多糖的Nm B疫苗的开发[5]。对于B血清群，目前的Nm B商业疫苗由OMVs和/或重组蛋白制成[6]。因此，这些复杂的生物产品需要深入的分析理解，这对于确保疫苗生产的稳定性至关重要。

在Nm B疫苗中存在的杂质中，残留的荚膜多糖（CapsPS）是一个重要问题。这些生物大分子在生产过程中无法完全消除，必须对其进行监测[7]。荚膜多糖是复杂的、庞大的碳水化合物结构，它们在某些细菌周围形成保护层，并通过逃避宿主的免疫反应来增强细菌的毒力。研究表明，Nm B血清群的这种特定CapsPS在成人中不具有免疫原性[8]。尽管如此，在OMVs生产和最终阶段监测残留的CapsPS对于产品表征和生产工艺的稳定性仍然非常重要。Nm B的荚膜是由(α2→8)-连接的聚(N-乙酰神经氨酸)组成的，并通过1,2-二酰基甘油片段锚定在外膜上[9]。CapsPS通过高性能阴离子交换色谱法（HPAEC-PAD）进行定量，该方法在酸水解后释放N-乙酰神经氨酸（NeuAc）。这种方法可以测量CapsPS的总量，但不能提供关于多糖大小的信息。

自20世纪90年代初以来，毛细管电泳（CE）和胶束电动色谱法（MEKC）已被用于多糖的分离，无论是在没有胶束的情况下[10]，[11]，[12]，[13]，还是在存在胶束的情况下[10]，[12]，[14]，[15]，[16]，或者在凝胶中[17]，[18]，[19]，[20]，[21]。已经分析了多种寡糖和多糖，包括麦芽糖、淀粉和右旋糖酐[14]，[17]；透明质酸和硫酸软骨素的不对称二糖[13]；岩藻多糖[11]；甘露聚糖[15]；以及海藻酸盐[18]。基于可更换凝胶中的高分辨率分离，已经确定了硫酸化透明质酸和NeuAc聚合物的摩尔质量[19]，[20]，[21]。已有许多关于使用CE分析复杂多糖[22]，[23]和糖蛋白[24]的综述。

不同模式的CE也被用于疫苗表征[参见例如参考文献25中的综述]，包括人乳头瘤病毒（HPV）病毒样颗粒和脂质（角鲨烯）佐剂纳米乳液[26]，Vero细胞狂犬病疫苗中的宿主细胞残留DNA片段[27]，mRNA疫苗[28]，[29]，抗原亚单位和异构体[30]，口蹄疫病毒（FMDV）抗原[31]，以及灭活的脊髓灰质炎疫苗[32]，[33]。

关于CE在疫苗中多糖定量中的应用，Lamb等人使用MEKC在磷酸盐/硼酸盐缓冲液中，通过裸熔融石英毛细管分离并定量了针对不同Nm血清群的脑膜炎球菌多糖，这些多糖是疫苗的活性成分[16]。最近，Li等人使用CE-LIF定量了从Hericium erinaceus多糖中酶促释放的特定寡糖[12]。

在这项工作中，研究了使用涂层毛细管的MEKC作为一种先进的分析方法，该方法能够（i）定量和（ii）通过确定其聚合度和粒径分布来表征CapsPS残留物。这一目标的实现具有挑战性，因为样品中不仅含有CapsPS，还含有OMV残留物，必须将它们分离出来才能进行定量和表征。

部分内容

化学品

2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸（HEPES）和十二烷基硫酸钠（SDS）购自Sigma-Aldrich（法国Saint-Quentin Fallavier）。超纯水使用Millipore的MilliQ系统获得（法国Molsheim）。聚（二烯基二甲基铵氯化物）（PDADMAC；高分子量，M_w = 4 × 10⁵ – 5 × 10⁵ Da）20% w/w的水溶液购自Aldrich（法国Lyon）。聚（苯乙烯磺酸盐）（PSS；M_w = 7 × 10⁵ Da）购自Acros Organics

结果与讨论

图1展示了脑膜炎奈瑟菌（Nm，也称为脑膜炎球菌）的革兰氏阴性菌膜示意图，其中包括各种蛋白质抗原、脂寡糖和多糖荚膜。纯化的针对Nm B的OMVs具有类似的结构，除了通常在生产过程中被去除的多糖荚膜和肽聚糖。本工作的目标是定量和表征基于OMVs的疫苗中存在的残留CapsPS

结论

在这项工作中，我们证明了MEKC是一种强大的分离方法，可用于定量和表征OMVs批次中残留的CapsPS。定量结果与使用正交HPAEC-PAD方法获得的结果一致，并成功提取了额外的尺寸信息。这一成就的实现具有挑战性，因为PS的多分散性复杂且样品中存在OMV残留物。250 mM SDS的浓度足以实现完全分离

CRediT作者贡献声明

Laurent Leclercq：撰写——原始草稿，研究，数据分析。Hervé Cottet：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，资金获取，数据分析，概念化。Jean Dubayle：撰写——审阅与编辑，方法学，研究。Jérôme Thiebaud：方法学。Jean-François Cotte：撰写——审阅与编辑，方法学

利益冲突声明

Jean-François Cotte、Jérôme Thiebaud和Jean Dubayle是Sanofi的员工，可能持有该公司的股份和/或股票期权。Laurent Leclercq和Hervé Cottet声明没有利益冲突。

披露

这项工作部分由Sanofi在与蒙彼利埃大学和CNRS的合作研发协议下资助。

数据可用性

数据将应要求提供。

利益冲突声明

☒ 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

L.L.和H.C.声明没有利益冲突。

J.F.C.、J.T.和J.D.是Sanofi的员工，可能持有该公司的股份和/或股票期权。

致谢

感谢Marina Brossaud（Sanofi）提供脑膜炎奈瑟菌多糖样本。感谢Denis Bouchard和Alain Médard（Sanofi）协助进行HPAEC-PAD实验。感谢Christelle Fontaine（Sanofi）对这项研究的支持。作者感谢Jean-Sébastien Bolduc（Sanofi）对手稿的校对。