1 引言
卵子发生是一个高度协调的发育过程，对雌性生育力至关重要。在卵泡生长过程中，卵母细胞体积扩大近300倍，并积累母源性mRNA和细胞器。其中，作为含有自身基因组(mtDNA)的半自主细胞器，线粒体在卵母细胞生长过程中经历大量复制，使得成熟卵母细胞含有数十万拷贝的mtDNA。这种剧烈的扩增确保了后续胚胎发生有足够的线粒体储备，因为从受精到囊胚阶段，mtDNA复制都处于静止状态。因此，早期胚胎发育依赖于卵子发生过程中建立的线粒体库。线粒体功能障碍与衰老、肥胖、糖尿病等增加不孕风险的因素相关。
在线粒体内，mtDNA与内膜上的核样体结合。线粒体转录因子A(TFAM)是一种核编码蛋白，是线粒体核样体的核心成分，它以类似组蛋白的方式包装mtDNA。通过其DNA结合特性，TFAM通过稳定、弯曲和解旋线粒体基因组以及在启动子区域启动转录来调节mtDNA复制和转录。维持最佳的TFAM与mtDNA比例对于线粒体稳态至关重要，因为无论是TFAM缺失还是过表达都会破坏mtDNA复制并减少mtDNA拷贝数。尽管其核心作用，TFAM在卵母细胞生长过程中的生理功能及其对mtDNA调控和卵母细胞发育能力的贡献仍不清楚。
值得注意的是，维持胚胎发育所需的mtDNA阈值水平在体内和体外环境中可能存在差异。体内卵泡环境通过间隙连接介导的通讯、代谢偶联和旁分泌信号提供复杂而动态的支持，这些在体外培养条件下未能完全复现。因此，在IVG来源的卵母细胞中，维持正常发育所需的mtDNA关键阈值可能高于体内来源的卵母细胞。
2 材料与方法
本研究使用了B6DBF1小鼠。在不同生长阶段分离卵母细胞，分析mtDNA拷贝数和线粒体生物发生相关基因的表达。为了评估TFAM功能，将靶向Tfam的siRNA显微注射到次级卵泡中，然后在IVG条件下培养12天。培养后，评估卵母细胞生长、mtDNA含量、线粒体膜电位以及体外受精(IVF)后的发育能力。通过实时定量PCR(qPCR)绝对定量mtDNA拷贝数，并使用免疫荧光、TMRM和CM-H2DCFDA染色分别评估TFAM蛋白表达、MMP和活性氧(ROS)水平。对卵母细胞进行体外成熟(IVM)、IVF和体外胚胎培养，评估受精率、胚胎发育率和囊胚细胞数。所有数据均使用GraphPad Prism 7进行统计分析。
3 结果
3.1 卵母细胞生长过程中mtDNA拷贝数的变化
研究发现，mtDNA拷贝数在卵母细胞生长过程中稳步增加，从早期卵母细胞的约5000拷贝增加到完全生长卵母细胞的约160，000拷贝。多项式二次回归分析显示拟合度极佳(R2= 0.9674)，表明卵母细胞生长过程中的mtDNA积累遵循非线性模式，在生长后期加速。
3.2 卵母细胞生长过程中线粒体调控基因表达的变化
对初级、次级和完全生长卵母细胞中线粒体生物发生、mtDNA复制和线粒体质量控制相关基因的表达分析显示，Twinkle、Polg、Nrf1、Nrf2、Sirt1和Parkin的转录本在卵母细胞生长过程中逐渐增加，在后期阶段显著上调。值得注意的是，TfammRNA在次级卵泡阶段表现出急剧增加，而线粒体自噬的关键调节因子Pink1在该阶段下调。这些发现表明，随着卵母细胞成熟，线粒体生物发生增强，并且次级卵泡阶段代表了一个以增强mtDNA复制和减少线粒体更新为特征的关键转折点。
3.3 TFAM敲低降低mtDNA拷贝数和线粒体膜电位
通过RNA干扰技术敲低Tfam后，免疫荧光和qPCR证实了卵母细胞中TFAM的高效敲低。经过12天的IVG培养，TFAM耗竭对卵泡存活率或卵母细胞大小没有明显影响。然而，TFAM敲低显著降低了mtDNA拷贝数。线粒体功能评估显示，TFAM耗竭并未显著改变ROS水平，但显著降低了MMP。这些结果证明，TFAM对于卵母细胞生长过程中正确的mtDNA扩增和线粒体功能完整性的维持是必不可少的。
3.4 TFAM敲低损害受精后的发育潜能
研究进一步检查了TFAM耗竭对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响。IVG后，对卵母细胞-卵丘复合体进行IVM、IVF和体外胚胎培养。TFAM敲低卵母细胞的成熟率和减数分裂进程与对照组相当。纺锤体形态和MII期的染色体排列在两组中也均表现正常，表明TFAM耗竭不会破坏减数分裂能力。受精率也未受影响。
然而，在植入前发育过程中，研究人员观察到从4细胞阶段开始，发育进程显著减慢。随后囊胚形成率显著下降，同时每个囊胚的总细胞数减少。为了进一步评估早期胚胎中的线粒体功能，研究人员评估了单细胞胚胎的MMP和线粒体含量。TFAM敲低胚胎的MMP显著降低，而线粒体含量及其分布未改变，这表明MMP降低反映的是线粒体功能受损，而非线粒体丰度减少。
总而言之，这些发现表明，尽管TFAM耗竭不影响卵母细胞成熟、受精或线粒体含量，但它通过损害MMP严重损害了受精后的发育能力，强调了TFAM介导的mtDNA复制在建立卵母细胞发育能力中的关键作用。
4 讨论
本研究描述了从早期初级卵泡到窦状卵泡的卵子发生过程中mtDNA积累的动态变化。mtDNA拷贝数与卵母细胞直径之间的关系是非线性的，在卵母细胞生长的后期阶段加速增加。值得注意的是，TfammRNA表达显著增加，而Pink1表达在次级卵母细胞阶段下降，这表明mtDNA复制增强，而线粒体自噬受到抑制。这些发现共同表明，在卵子发生过程中，线粒体稳态发生了转变，其中生物发生优于降解，以确保受精前有足够的线粒体含量。
TFAM被证明对卵子发生过程中的mtDNA复制至关重要。RNAi介导的Tfam敲低抑制了mtDNA积累，证实了其在线粒体生物发生中的关键作用。虽然减数分裂成熟未受影响，但TFAM敲低导致MMP显著降低。鉴于线粒体含量和分布未改变，这种功能损伤很可能归因于每个线粒体的mtDNA拷贝数减少。
减少的mtDNA拷贝数与卵母细胞质量随年龄增长而下降以及卵巢功能不全等生殖病理有关。相比之下，条件性Tfam敲除模型显示，mtDNA严重减少的卵母细胞仍能发育到囊胚阶段，这可能是由于体内卵泡环境的补偿性支持。虽然植入前胚胎可以耐受相对较低的mtDNA拷贝数，但植入后发育需要高于关键阈值的mtDNA水平，而这通常由完整的体内卵泡环境支持。卵母细胞严重依赖平衡的脂质和葡萄糖代谢来产生能量，这由卵泡环境支持并通过周围的卵丘细胞供应。卵母细胞与卵丘和颗粒细胞之间的双向通讯在体内是强大的，但在IVG条件下未能完全重建。因此，IVG培养系统缺乏足够的代谢缓冲能力，使得线粒体功能障碍在更早的发育阶段成为限制因素。在这种情况下，IVG来源的卵母细胞维持正常胚胎发育所需的mtDNA关键阈值可能高于体内生长卵母细胞的报告值。TFAM缺乏可能进一步加剧这些线粒体异常，表明TFAM表达不足与mtDNA耗竭共同导致了IVG卵母细胞的线粒体功能障碍。
IVG系统产生的卵母细胞表现出异常的线粒体分布、mtDNA含量减少和代谢功能受损，这些都导致了发育能力的下降。在本研究中，对照IVG卵母细胞的mtDNA拷贝数范围很广，平均每个卵母细胞约为120，000拷贝。相比之下，先前使用液滴数字PCR（一种高度灵敏和准确的定量方法）的研究报告称，性成熟小鼠的完全生长卵母细胞每个含有大约140，000–150，000个mtDNA拷贝。这种差异进一步强调了IVG卵母细胞质量的次优性，并可能部分解释了本研究中观察到的表型。因此，优化IVG条件以更好地模拟生理性线粒体生物发生可能会提高卵母细胞质量和发育结果。鉴于IVG期间TFAM敲低会减少mtDNA含量，可以推测补充外源性TFAM可以恢复mtDNA拷贝数并挽救IVG相关的缺陷。然而，先前的研究表明，过度的TFAM表达反而会降低mtDNA水平。过量的TFAM促进过度的核样体压缩，从而抑制mtDNA复制和转录。因此，精确微调TFAM表达以恢复生理性的TFAM与mtDNA比例在技术上仍具有挑战性。未来旨在增强内源性TFAM表达或调节线粒体生物发生上游调节因子的策略可能为改进IVG培养系统提供替代方法。
致谢
本研究得到了日本学术振兴会对T.W.的资助（编号20K06627和23K08869）支持。资助者在研究设计、数据整理和分析或决定提交作品发表方面没有任何作用。作者还要感谢冈山大学仪器分析部使用FV1200进行的实验。
基金
本研究由日本学术振兴会（20K06627和23K08869）支持。
伦理声明
遵循了所有关于实验室动物护理和使用的机构和国家的指导方针。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。
