泛素及泛素样蛋白质(Ubls)是细胞内关键的翻译后修饰因子，其共价连接与去连接循环调控着从蛋白质降解到信号转导等一系列核心细胞进程。研究这些动态且可逆的过程需要能够直接捕捉酶活性形式的工具，活性依赖性探针（ABP）为此提供了独特的解决方案。本综述聚焦于设计和合成靶向Ubl修饰系统的ABP的化学策略，旨在为解码Ubl信号网络提供功能研究的化学工具集。
Intein介导的半合成与表达蛋白连接
基于Intein的半合成是获取带有反应性C末端Ubls的强大方法。此方法利用内含肽的自剪接机制，通过表达Ubl-内含肽融合蛋白，经硫醇诱导裂解生成Ubl硫酯，随后通过与含电弹头的胺进行选择性氨解，从而安装电弹头。例如，Hemelaar等人通过该方法合成了NEDD8、ISG15和SUMO-1的乙烯基砜(VS)探针，这些探针能通过迈克尔加成共价标记其相应的蛋白酶（如SENPs）。此外，通过整合点击化学（如CuAAC），可以将Ubls与标记或生物正交手柄连接，为生物偶联物的构建提供了便利。
天然化学连接与辅助基介导的肽连接
天然化学连接(NCL)作为蛋白质全合成的基石，通过一个肽段的C末端硫酯与另一个肽段的N末端半胱氨酸反应，形成天然肽键。这种方法能够组装全长Ubl并可在连接处引入电弹头、标签或其他修饰。一个复杂的应用案例是Ovaa课题组报道的K11连接的双SUMO-2乙烯基酰胺ABP的合成，该工作巧妙利用了辅助基介导的连接策略，在异肽键位点引入了乙烯基酰胺电弹头。此外，α-酮酸-羟胺(KAHA)连接作为一种替代方案，因其化学选择性高、反应清洁且副产物仅为水和二氧化碳而备受关注。
激活半胱氨酸定向蛋白质连接——非Intein半合成
激活半胱氨酸定向蛋白质连接(ACPL)是一种无需内含肽即可在Ubl的C末端进行修饰的新兴技术。该技术通过对重组Ubl的C末端半胱氨酸进行氰基化激活（如使用NTCB试剂），使其形成高活性的1-酰基-2-亚氨基噻唑烷中间体，进而被亲核胺进攻，直接将胺类电弹头或报告基团安装到C末端。这种方法操作简便、快速且可扩展，已成功应用于制备泛素-丙炔胺(PA)、泛素-AMC以及一系列Ubl-ACA荧光底物探针。
C末端酰肼化学与酰化反应
肽C末端酰肼是蛋白质半合成中的重要中间体，可被转化为多种其他官能团。通过酰肼的活化，例如用亚硝酸钠处理生成酰基叠氮，可进一步与胺或硫醇反应，分别生成带有电弹头的探针或硫酯。一种更便捷的方法是Bode课题组开发的酸酐一步酰化法，在酸性条件下，Ubl酰肼的末端肼基可被特定酸酐选择性酰化，从而直接安装如氯乙酰基等电弹头。这种方法简化了探针合成步骤，尤其适用于快速构建探针库。
基于全固相肽合成的完整路线
尽管Ubls通常为75-100个氨基酸的蛋白质，但通过优化的固相肽合成(SPPS)策略，包括使用“聚集破坏剂”和分段合成-连接策略，可以实现其全化学合成。这种方法提供了最大的灵活性，可以在任意位点引入非标准氨基酸、翻译后修饰或电弹头前体。例如，通过SPPS可以在肽链中直接掺入光笼保护甘氨酸或脱氢丙氨酸等特殊氨基酸，从而构建可光控激活或具有独特反应性的探针。
酶催化方法
除了化学方法，酶催化策略也被用于Ubl探针的合成。Sortase-A介导的连接可以利用其转肽酶活性，将含有LPXTG基序的Ubl与含有N端寡聚甘氨酸的电弹头或标签肽连接。此外，利用Ubl的E1激活酶在ATP驱动下形成高能E1∼Ubl硫酯中间体的特性，可以将其截获并与外源亲核试剂（如PA或VS）反应，直接生成Ubl-电弹头探针。基于E2/E3的连接策略，如利用Ubc9对IKXE基序的特异性识别进行Ubl转移的LACE方法，也为构建特定的Ubl-底物偶联物提供了途径。
新兴策略
前沿的合成策略不断拓展Ubl探针的功能边界。光笼控探针通过在关键位置引入光保护基团，实现了对探针活性的时间精确控制。双功能或双反应性探针（如含有双电弹头的二泛素探针）可用于同时捕获酶的多个活性位点。遗传密码扩展技术允许在Ubl表达时直接掺入含有潜伏电弹头前体的非天然氨基酸，随后通过化学转化激活。此外，新型连接化学如SEA硫酯替代物、无添加剂乙烯基噻蒽鎓天然化学连接以及水杨醛酯介导的丝氨酸/苏氨酸连接等，正为复杂Ubl探针和偶联物的高效合成开辟新途径。
探针的标记与检测策略
为了使酶-探针复合物可被检测和富集，Ubl探针通常需要引入报告标签。主要策略分为两类：一是直接在合成或表达过程中引入内置标签（如N端的HA、His6标签或生物素、荧光染料）；二是引入生物正交反应手柄（如末端炔烃或叠氮），在探针标记目标酶后，再通过点击化学连接上所需的报告基团（如荧光素-叠氮或生物素-叠氮）。内置标签简化了工作流程，而点击化学手柄则提供了更高的灵活性和模块化，尤其适用于活细胞内的多路复用检测。
电弹头化学与选择性
探针的电弹头决定了其反应机制和目标酶谱。乙烯基甲基酯(VME)和乙烯基砜(VS)等迈克尔受体通过共轭加成与催化半胱氨酸形成稳定的硫醚键。丙炔胺(PA)则通过1,2-直接加成反应，其形成的加合物可在酸性条件下解离，具有可逆性。氯乙酰基等亲电体则通过亲核取代反应。不同的弹头对不同类型的酶（如半胱氨酸蛋白酶与JAMM金属蛋白酶）具有不同的反应性和选择性。此外，还有模拟天然中间体（如Ub-腺苷酸类似物）以靶向E1激活酶的探针设计。研究者根据目标酶的催化机制和所需的应用场景（如活细胞成像、蛋白质组学谱分析或抑制剂筛选）来精心选择或设计电弹头。
