引言
医院环境是病原菌和抗生素抗性基因的储存库，对医院获得性感染（HAIs）的发生有重要贡献。粘质沙雷氏菌是一种广泛存在于环境中的革兰氏阴性机会致病菌，易在免疫功能低下人群中传播，尤其是在重症监护室和新生儿重症监护室。它能抵抗多种抗生素，并可引起脑膜炎、肺炎、心内膜炎和蜂窝织炎等严重疾病。在群体感应（QS）系统调控下，粘质沙雷氏菌能够形成生物膜，这进一步增强了其对环境的适应性、传播能力和抗生素抗性。
噬菌体是能特异性感染细菌的病毒，是自然界中最丰富的微生物，也是对抗耐药菌的有力工具。噬菌体疗法曾作为一种抗菌策略使用，但随着抗生素的出现，其临床应用有所减少，而近期又因全球抗生素耐药性的上升而复兴。噬菌体因其高特异性，可以选择性靶向耐药菌及其生物膜，而对有益微生物群无不良影响。此外，噬菌体与抗生素的联合使用已显示出增强抗生素疗效和降低耐药性的潜力。随着噬菌体疗法的不断进步，其在水处理、食品加工、水产养殖和环境消毒等领域的应用正逐步实现。本研究分离并表征了一株新型噬菌体BUCT805，评估了其清除塑料表面粘质沙雷氏菌生物膜的效能，强调了其在环境消毒方面的潜力。
材料与方法
细菌培养：研究中使用的粘质沙雷氏菌菌株来自Tong实验室收藏，包括环境分离株和临床菌株。所有菌株均以50%（体积/体积）甘油保存在-80°C。最初，将菌株划线于LB琼脂平板上，在37°C培养12小时。随后，挑取单菌落接种于LB肉汤中，在37°C摇床培养12小时以达到指数生长期。
噬菌体分离与纯化：以粘质沙雷氏菌菌株SM04为宿主，从污水样品中分离噬菌体。简要步骤为：取15 mL污水，在11,000 × g 下离心10分钟，上清液通过0.22 μm膜过滤。将滤液与菌株SM04在LB肉汤中混合，在37°C、180 rpm振荡培养24小时。孵育后，再次离心，取上清过滤。取100 μL过滤上清与100 μL SM04的过夜培养物混合于LB软琼脂中，倾注于LB琼脂平板上待凝固。平板在37°C孵育12小时。挑取单个噬斑，通过相同程序进行三轮纯化。为制备高滴度噬菌体溶液，将纯化的噬菌体与30%蔗糖溶液按4:1比例混合，在4°C、30,000 × g 下离心2小时，弃上清。所得噬菌体沉淀重悬于200 μL PBS中，制成浓缩噬菌体储备液。
透射电子显微镜（TEM）观察：取50 μL纯化的BUCT805噬菌体悬液（1010PFU/mL）滴加在碳膜铜网上，室温干燥30分钟。去除多余液体后，用2%磷钨酸负染。待室温完全干燥后，使用透射电子显微镜在100 kV电压下观察噬菌体BUCT805的形态特征。
宿主范围测定：为确定BUCT805的宿主范围，测试了实验室收集的20株粘质沙雷氏菌。每株菌在LB肉汤中于37°C、180 rpm摇床培养8小时。然后，取200 μL菌液与LB软琼脂混合，倾注于LB琼脂平板上。将不同滴度（103, 104, 105, 106, 107, 108PFU/mL）的BUCT805噬菌体悬液各2 µL点种于软琼脂层表面，并以等体积PBS作为阴性对照。平板在37°C过夜培养，观察噬斑的形成以评估噬菌体的感染性。
最佳感染复数（MOI）与一步生长曲线测定：为确定最佳MOI，将100 μL不同滴度的噬菌体悬液与100 μL细菌悬液（108CFU/mL）混合，以达到MOI值分别为10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001。将每种混合物加入到5 mL LB肉汤中，在37°C、180 rpm振荡培养12小时。孵育后，取1 mL混合物，在11,000 × g 离心3分钟，上清通过0.22 μm膜过滤，然后测定噬菌体滴度。此实验重复三次，产生最高滴度的MOI被视为最佳MOI。
为分析噬菌体BUCT805的潜伏期、裂解期和裂解量，绘制了一步生长曲线。将500 µL粘质沙雷氏菌SM04（5 × 108CFU/mL）与500 µL噬菌体BUCT805（5 × 107PFU/mL）混合。混合物孵育10分钟以允许吸附。然后，将混合物在11,000 × g 离心2分钟，弃上清。将沉淀重悬于PBS，并重复洗涤过程两次。随后，将1 mL洗涤后的混合物转移至49 mL LB肉汤中，在37°C、220 rpm振荡培养。在3小时内每隔一段时间取样，每个样品通过0.22 μm膜过滤。使用软琼脂覆盖法测定噬菌体滴度。此实验重复三次，计算平均噬菌体滴度。
温度稳定性和pH稳定性测定：为评估噬菌体BUCT805在不同温度条件下的稳定性，将1 mL纯化的噬菌体BUCT805（2.5 × 1010PFU/mL）转移到1.5 mL离心管中，在不同温度下孵育2小时。然后使用软琼脂覆盖法测定噬菌体滴度。类似地，为评估在不同pH条件下的稳定性，将噬菌体（2.5 × 1010PFU/mL）在不同pH值的缓冲液中于37°C孵育2小时。使用软琼脂覆盖法测定噬菌体滴度。每个实验重复三次，计算平均值。
噬菌体DNA测序与生物信息学分析：使用噬菌体基因组DNA提取试剂盒，按照制造商的说明提取噬菌体DNA，采用PEG沉淀法分离DNA。随后，使用NEBNext Ultra II FS DNA文库制备试剂盒在Illumina NovaSeq平台上进行下一代测序。使用Trimmomatic 0.36对原始数据进行质量控制，去除低质量reads，然后使用SPAdes v3.13.0进行组装。使用RAST工具预测噬菌体的开放阅读框（ORF），并使用NCBI的BLASTp对ORF进行功能注释。为了构建噬菌体的蛋白质组树，将组装好的序列与NCBI BLASTn结果进行比较，并使用在线工具ViPTree进行分析。
生物膜清除效果评估：将浓度为106CFU/mL的细菌悬液200 µL加入96孔板的每个孔中，在37°C避光孵育24小时，使孔表面形成生物膜。孵育后，移除上清，用200 µL PBS缓慢洗涤孔两次。随后，去除所有液体，让板在室温下干燥1小时。完全干燥后，向含有预形成生物膜的孔中加入滴度范围为104到109PFU/mL的噬菌体200 µL，以等体积PBS作为对照。然后将板在37°C避光孵育4小时。处理后，移除上清，用200 µL PBS轻轻洗涤孔两次。让板在室温下干燥30分钟。随后，加入200 µL 0.1%结晶紫溶液染色15分钟。染色后，去除多余染料，用95%乙醇脱色20分钟。测定550 nm处的光密度（OD）以量化生物膜形成。每个实验重复三次，计算平均值。
统计分析：所有数据均使用GraphPad Prism 10.1.2进行处理。噬菌体的MOI、温度稳定性和pH稳定性使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较检验进行分析。噬菌体对生物膜清除的影响使用t检验进行分析。每个实验进行三次重复，计算平均值和标准差。P < 0.05被认为具有统计学意义。
结果与讨论
噬菌体BUCT805的形态特征
从污水中分离出一株新型噬菌体，命名为BUCT805，宿主为粘质沙雷氏菌SM04。噬菌体BUCT805在SM04菌苔上形成清晰的噬斑，平均直径约为3.36 ± 0.63 mm。噬斑具有透明的中心和规则的形状，周围环绕着半透明的晕圈。TEM图像显示，噬菌体BUCT805的头部平均直径约为53.89 ± 1.91 nm，尾部平均长度约为103.27 ± 2.39 nm。
宿主范围
噬菌体的宿主范围是影响其治疗效果和在不同领域应用的关键因素。为评估噬菌体BUCT805的宿主范围，我们选择了20株来自不同来源（临床和环境）的粘质沙雷氏菌株，评估了BUCT805裂解这些菌株的能力。结果显示，噬菌体BUCT805可以裂解50%的所选菌株。除了原始宿主菌株SM04，BUCT805还在另外9株粘质沙雷氏菌株（1219, 1261, 1413, 2860, 2861, 2862, 2863, 2864, 2865）的菌苔上形成了清晰、界限分明的噬斑。与先前研究相比，噬菌体BUCT805表现出比噬菌体ϕIF3（仅能感染39株测试菌株中的2株）和噬菌体UFV01（仅对其原始分离株具有感染性）更广的宿主范围。
噬菌体BUCT805的最佳MOI和一步生长曲线
为确定噬菌体BUCT805的最佳MOI，将其与粘质沙雷氏菌SM04以不同MOI混合。当MOI为0.1时，平均噬菌体滴度（6.06 × 109PFU/mL）显著高于其他组。因此，确定BUCT805的最佳MOI为0.1。随后，以最佳MOI混合噬菌体BUCT805和粘质沙雷氏菌SM04，测定并绘制一步生长曲线。从0到25分钟，噬菌体BUCT805处于潜伏期，滴度没有显著变化。潜伏期后，噬菌体滴度在25到50分钟之间从2.73 × 105迅速增加到6.43 × 107PFU/mL。50分钟后，噬菌体滴度的增加逐渐减缓，在120分钟时达到平台期并稳定下来。裂解量定义为每个感染细胞释放的平均噬菌体颗粒数。噬菌体BUCT805的裂解量计算为（裂解后滴度 − 初始滴度）/感染的细菌细胞数，结果为338 ± 17 PFU/感染细胞。与之前报道的噬菌体P-UFV01每个感染细胞释放157个病毒颗粒相比，噬菌体BUCT805表现出更高的裂解量，这表明其具有很强的杀菌潜力。
噬菌体BUCT805的温度和pH稳定性
噬菌体BUCT805在4°C至45°C的温度范围内孵育2小时，滴度保持相对稳定，未观察到显著变化。然而，当温度升高到55°C时，2小时后滴度与37°C下的滴度相比下降了约10倍。随着温度进一步升高到65°C，在相同时间内滴度与37°C下的滴度相比下降了约2 × 106倍。这些结果表明，噬菌体BUCT805在室温下表现出相当的稳定性，而在高温条件下其稳定性下降。BUCT805在pH 4–11范围内孵育2小时，滴度保持相对稳定，在pH 7时达到最大滴度2.51 × 1010PFU/mL。在pH 3时，滴度约为pH 7时的2 × 107分之一。在pH 13孵育2小时后，滴度降至0 PFU/mL。此外，噬菌体BUCT805表现出优于噬菌体UFV01的pH稳定性，尽管其在高温条件下的稳定性不及噬菌体KKP_3709。这些发现表明，噬菌体BUCT805在强酸性或碱性环境中稳定性较差。
噬菌体BUCT805的基因组特征与ORF功能注释
噬菌体BUCT805的基因组长度为42,067 bp，G+C含量为47%。基因组分析显示，噬菌体BUCT805包含62个ORF，其中25个（40.3%）被注释为功能蛋白，而其余37个（59.7%）被归类为假设蛋白。
在噬菌体BUCT805中注释到的功能蛋白根据其基因功能分为四类：裂解、包装、复制和结构。分析显示，负责包装和尾部结构的蛋白主要位于基因组的前半部分，而参与裂解和复制的蛋白主要分布在基因组的后半部分。其中，ORF5、ORF6、ORF7和ORF8与包装相关，ORF33、ORF36、ORF37、ORF41、ORF48和ORF54参与复制。此外，ORF9、ORF10、ORF11、ORF12、ORF13、ORF14、ORF17、ORF23、ORF24、ORF25、ORF26和ORF28与噬菌体结构相关，ORF50、ORF51和ORF52与噬菌体裂解相关。
穿孔素是一种疏水蛋白，在细胞膜上形成孔道，从而为内溶素进入细胞提供途径，在裂解过程中起着至关重要的作用。大多数噬菌体产生双组分跨膜蛋白复合物来破坏外膜。对BUCT805基因组的分析揭示了三个裂解相关基因的同时存在：穿孔素（ORF50）、溶菌酶（ORF51）和I-跨膜蛋白（ORF52）。这些蛋白可能协同作用，有助于扩大宿主范围和增强裂解能力。研究它们的协同机制可能为工程化噬菌体的设计提供新的见解。此外，基因组分析表明，噬菌体BUCT805不携带任何已知的抗性基因或毒力因子。值得注意的是，假设蛋白占基因组的59.68%；对这些蛋白的进一步研究可能为噬菌体生物学提供新的视角。
噬菌体BUCT805的蛋白质组树
为了进一步研究噬菌体BUCT805与其他噬菌体之间的进化关系，使用在线工具ViPTree构建了一个包含90个噬菌体的蛋白质组树，噬菌体BUCT805是其中一员。结果显示，在进化关系上，噬菌体BUCT805与粘质沙雷氏菌噬菌体vB_SmaS_Ulliraptor更为接近。此外，Blastn搜索显示，噬菌体BUCT805与粘质沙雷氏菌噬菌体vB_SmaS_Serratianator具有最高的相似性，查询覆盖率为88%，序列一致性为79.82%。基于这些发现，推断噬菌体BUCT805属于病毒域Duplodnaviria、界Heunggongvirae、门Uroviricota、纲Caudoviricetes。
噬菌体BUCT805的生物膜清除效率
粘质沙雷氏菌在导管或植入物上形成生物膜的能力增加了HAIs的风险。结果表明，尽管噬菌体BUCT805能够清除粘质沙雷氏菌的生物膜，但其对不同菌株的效果存在差异。具体而言，滴度为109PFU/mL时，对菌株SM04、2861、2862和2863的生物膜清除效果最佳，清除效率分别为59.39%、35.88%、39.59%和59.08%。相比之下，噬菌体BUCT805对菌株1219的生物膜清除能力最弱，在109PFU/mL滴度下4小时内仅清除了约22.34%的生物膜。当噬菌体滴度降至108到104PFU/mL之间时，未观察到对菌株1219的生物膜有显著清除。此外，噬菌体BUCT805对菌株2864的生物膜清除效果最为显著，在109PFU/mL滴度下4小时内实现了62.11%的清除率。总之，噬菌体BUCT805展现出清除塑料表面粘质沙雷氏菌生物膜的潜力。
生物膜是由细菌和胞外聚合物形成的自产水合基质组成，增强了粘质沙雷氏菌在医院环境中的定植和传播潜力。噬斑周围晕圈的存在表明该噬菌体可能编码一种解聚酶，这需要进一步的实验验证。在这项研究中，证明了噬菌体BUCT805可以在4小时内有效清除塑料表面的粘质沙雷氏菌生物膜。尽管噬菌体BUCT805的生物膜清除效果因菌株而异，但研究结果支持了其在塑料表面消毒方面的潜在应用；然而，由于设备限制，在550 nm而非最佳波长下测量生物膜生物量，可能对检测灵敏度产生了轻微影响。
结论
从污水中分离得到的一株新型噬菌体BUCT805能够裂解粘质沙雷氏菌并有效清除其生物膜。噬菌体BUCT805在不同的温度和pH值下表现出相对良好的稳定性，并且具有较高的裂解量。此外，基因组分析表明，噬菌体BUCT805不携带任何已知的抗性基因或毒力因子。值得注意的是，假设蛋白占基因组的59.68%。未来的研究应进一步阐明BUCT805基因组编码的假设蛋白的功能，并探索噬菌体、益生菌和化学消毒剂联合治疗策略。
