聚(ADP-核糖)聚合酶（PARPs）是一类参与DNA修复和细胞信号传导的18种酶[1],[2]。PARPs最早于1963年被发现，包括PARP1和PARP-2等成员[3]。PARP1主要定位于真核细胞核内，催化NAD+分子中的ADP-核糖基团转移到自身或其他底物蛋白上，形成长的分支状聚(ADP-核糖)（PAR）聚合物[4],[5]。这些催化产物在多种细胞过程中起关键作用，如转录调控、细胞分化和细胞凋亡[6]。作为普遍存在的核蛋白，PARP1还在DNA代谢、基因表达、DNA修复、染色体维持和染色质重塑等多个方面发挥重要作用[7]。越来越多的证据表明，PARP1的功能或活性异常与多种疾病相关，如癌症、HIV感染、糖尿病和炎症性疾病[8],[9]。值得注意的是，在肺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞中PARP1的活性显著升高[9],[10],[11]。因此，PARP1被视为癌症诊断和治疗的宝贵生物标志物。因此，灵敏、特异性和快速检测PARP1对于生物医学研究、早期临床诊断和治疗干预至关重要。
传统的PARP1检测方法包括放射性检测[12]、裂解荧光素酶互补检测[13]和酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]。然而，这些方法存在一些固有的局限性。例如，放射性检测存在放射性污染和生物安全风险；裂解荧光素酶互补检测需要耗时的化学衍生化步骤；而ELISA依赖昂贵的抗体。此外，还开发了利用无机纳米材料（如二氧化锰（MnO2）纳米片[15]和金纳米棒（AuNRs）[16]的新方法进行PARP1检测。这些方法依赖于纳米材料与PARP1活性产物（PAR聚合物）之间的相互作用产生的信号。这种相互作用通过非共价静电力实现，但结合亲和力较弱，从而影响PARP1识别的准确性[17]。此外，还采用了电化学技术进行PARP1检测[18],[19],[20]，但它们受到灵敏度低、动态范围窄以及需要在电极表面固定特定双链DNA的局限性的影响，这一过程耗时较长。最近，张氏团队将DNA扩增策略整合到PARP1检测中[17]，提供了一种简单且灵敏的检测方法。
规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统在原核生物中作为一种适应性免疫机制，能够抵抗噬菌体或质粒等外来遗传元素的入侵[21],[22]。CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas）在该系统中起核心作用，具有可编程性、可预测性和稳定性等优势[23]。基于这些特性，CRISPR/Cas蛋白已被广泛应用于分子诊断领域，包括生物标志物检测和原位成像等应用。例如，薛等人提出了一种基于CRISPR/Cas的数字检测方法，用于快速和超灵敏地检测病毒DNA/RNA[24]；杨等人开发了一种近距保证的CRISPR/Cas系统，用于准确识别乳腺癌细胞外囊泡[25]；Bagheri等人引入了一种响应输入的CRISPR/Cas系统用于传感应用[26]。在这些系统中，CRISPR/Cas蛋白的激活需要特定的目标单链或双链核苷酸序列。这种激活机制通常通过目标识别引发的链置换反应（SDRs）来实现。具体来说，当引入特定目标（如核酸、蛋白质或细胞外产物）时，会启动SDR反应，生成所需的靶向DNA序列以激活CRISPR/Cas蛋白。然而，这种机制通常只能激活一个CRISPR/Cas蛋白，限制了整体激活效率。
杂交链反应（HCR）是一种无需酶的扩增技术，通过两个发夹结构生成长的、序列重复的双链DNA聚合物[27],[28]。HCR产物满足CRISPR/Cas蛋白的激活要求，能够同时结合多个CRISPR/Cas蛋白，从而显著提高CRISPR/Cas系统的激活效率[29],[30]。在本研究中，开发了一种双向HCR激活的CRISPR/Cas12a级联系统用于检测PARP1。设计了一种双链识别探针（dsRP），其中包含PARP1的特异性识别位点和两个悬挂式触发序列以启动双向HCR。加入PARP1后，会形成生物素化的dsRP-PARP1-PAR聚合物复合物，可通过磁分离分离出来。随后，引入发夹结构H1和H2，从dsRP两端的悬挂式触发序列启动HCR反应，实现双向扩增并生成序列重复的双链DNA聚合物。值得注意的是，HCR产物可作为Cas12a蛋白的靶序列，从而形成高效的CRISPR/Cas12a级联系统，促进报告分子的切割。该方法背景信号低，灵敏度高，PARP1的检测限（LOD）达到2.5×10^-5 U/mL，比单向HCR激活的CRISPR/Cas12a系统低两个数量级。此外，还进行了抑制剂检测，并成功监测了多种肿瘤细胞系中的PARP1活性。本研究的优势在于开发了一种新型的双向HCR激活CRISPR/Cas12a策略，这在之前的研究中尚未报道。实验结果表明，这种双向方法在信号放大和灵敏度方面具有显著优势。此外，该策略成功应用于PARP1的检测，拓宽了其应用范围，为实际样本中的PARP1检测提供了一种可靠的新方法。因此，这种方法提供了一种灵敏且高效的CRISPR/Cas激活策略，具有重要的应用潜力，适用于PARP1检测及相关分子诊断、抑制剂筛选和活性监测。
