EBV BART microRNA 在胃癌中的表达谱及其宿主基因的关联
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引言
胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤和第四大癌症相关死亡原因，每年有超过100万新发病例和约76.9万例死亡。由于早期症状不特异且缺乏可靠的早期检测生物标志物，大量患者在晚期才被确诊，此时治愈性治疗选择有限。这些临床挑战凸显了对胃癌进行更精确分子分层、寻找有生物学信息标记物的迫切需求。根据癌症基因组图谱计划（TCGA）的研究，胃癌可分为四个主要分子亚型，其中EB病毒相关胃癌（EBVaGC）约占8-10%，是一个独特的生物学实体。其特征包括淋巴上皮瘤样组织学、密集的免疫细胞浸润、极端的CpG岛甲基化表型、复发性PIK3CA突变以及免疫检查点基因（如PD-L1、PD-L2）的频繁扩增或过表达。全球范围内，EBVaGC每年导致超过10万新病例，表明EBV感染在肿瘤生物学和肿瘤-免疫相互作用中扮演着主动和持续的角色，而非被动伴随事件。
EBVaGC的一个关键分子特征是EBV编码的microRNA的持续高表达。EBV编码约25个前体miRNA，可产生超过40个成熟miRNA，主要来源于BamHI-A向右转录本（BART）区域。EBV miRNA已被证明可调节多种癌症相关过程，包括细胞凋亡、细胞周期控制、干扰素信号传导、免疫逃逸、上皮-间质转化和肿瘤微环境重塑。在EBVaGC中，BART miRNA持续高表达，可靶向抑癌基因、调节抗原呈递通路并促进EBV感染上皮细胞的存活。然而，原发性胃癌组织中的EBV-miRNA表达模式仍未得到充分表征。许多已发表的研究受限于样本量小，或主要关注宿主miRNA，缺乏独立患者队列的验证。此外，很大一部分关于EBV-miRNA功能的机制性见解来自体外模型系统，来自临床肿瘤标本的直接证据相对有限。本研究采用一种整合方法，结合胃癌组织的小RNA测序和选定EBV-miRNA的qPCR验证，旨在定义EBVaGC中可重复且具有生物学意义的EBV来源miRNA特征。
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材料与方法
这项研究遵循赫尔辛基宣言，并获得马尔马拉大学伦理委员会的批准。研究纳入了在2024年1月1日至2024年7月1日期间诊断并随访的胃癌患者，最终有21名患者入组。从所有患者术前收集外周血样本，并在术中获取肿瘤组织样本。从12名患者中获得了配对的胃癌组织和外周血样本，仅从9名患者中收集了外周血样本。
使用试剂盒从肿瘤组织和血浆样本中提取总RNA。对于宿主基因表达分析，使用逆转录试剂盒合成cDNA，并使用定量PCR试剂盒进行分析。PTEN、BCL2L11 (BIM)、FOXO3、CDKN1A (p21) 的表达水平以RPII为内参基因进行标准化，并使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。对于EBV-miRNA分析，使用miRNA逆转录试剂盒进行cDNA合成，并使用定量PCR试剂盒进行检测。对EBV BART miRNAs（包括miR-BART19-3p、miR-BART1-5p、miR-BART10-3p、miR-BART6-3p、miR-BART13-5p和miR-BART22）的表达水平进行了定量。选择RNU6和SNORD作为内参对照。相对miRNA表达也通过2-ΔΔCt方法计算。
对11个GC患者的肿瘤组织进行了小RNA测序。经过接头去除、低质量读取过滤后，使用Galaxy软件对获得的clean reads进行分析。将读取与miRBase第21版进行比对，以识别成熟miRNA。miRNA表达水平以每百万计数（CPM）进行标准化，表达水平低于100 CPM的miRNA被排除在后续分析之外。将clean reads与EBV参考基因组（NC_007605）进行比对，并使用featureCounts对EBV编码的成熟miRNA进行识别和计数，同样以CPM进行标准化。阳性对照样本通过来自GEO数据库的RNAseq数据集（包括P3HR1伯基特淋巴瘤细胞系和AGS-EBV阳性胃癌细胞系）进行了验证。
使用ViRBase进行计算机病毒-宿主相互作用分析。对研究中检测到的EBV来源的miRNA进行查询，以识别假定的宿主靶基因。使用热图工具和R软件包绘制EBV-miRNA在肿瘤样本中表达模式的热图。使用软件进行统计分析。数据以均值±标准差表示，并使用方差分析和事后检验进行组间比较，p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。
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结果
通过与EBV参考基因组比对的小RNA测序显示，胃癌队列中EBV来源的病毒miRNA表达存在异质性。在一部分样本中检测到EBV来源的读取，且主要集中在两个患者的肿瘤中，这两个样本共同构成了观察到的大多数病毒miRNA计数。在这些EBV富集的肿瘤中，病毒miRNA谱以BART来源的物种为主，miR-BART19-3p、miR-BART1-5p、miR-BART6-3p、miR-BART10-3p、miR-BART13-5p和miR-BART22持续高表达。人类RNAseq读取与EBV基因组的比对显示，读取能清晰地比对到成熟miR区域。尽管EBV阳性样本之间的总EBV-miRNA丰度存在差异，但单个BART miRNA的相对分布具有可比性，表明EBV富集肿瘤中存在保守的病毒miRNA组成。在EBV阳性的AGS-Akata胃癌细胞系中也观察到了类似的miRNA分布模式。在扩大队列中进行的靶向RT-qPCR分析验证了测序结果，并证明了选定EBV-miRNA的可重复表达，支持了本研究中确定的EBV-miRNA表达模式的稳健性和可重复性。
3.1. 患者队列特征
GC队列的临床病理特征被总结。该队列包括处于不同肿瘤分期、解剖位置和组织学亚型的患者，涵盖了肠型和弥漫型胃癌。对部分病例进行了EBER原位杂交检测，并将其描述性使用而非纳入标准。在本研究中，EBER状态反映了病毒存在的组织病理学证据，而EBV BART miRNA丰度则代表了在分子水平上测量的转录活性。没有单一的临床病理变量与EBV BART miRNA阳性完全分离，这表明可检测的病毒转录活性并不局限于特定的肿瘤分期或组织学分类。
3.2. 小RNA测序分析EBV-miRNA谱
对11名GC患者的肿瘤组织进行了小RNA测序。样本2因RNA质量未达到预定义的纳入标准而被排除在分析之外。在一部分肿瘤样本中检测到EBV-miRNA读取，总病毒miRNA丰度在样本间存在显著差异。总EBV-miRNA读取计数范围从每个样本1到1421个读取，反映了整个队列中EBV转录活性的异质性。与其余肿瘤相比，样本S1和S6显示出显著更高的EBV-miRNA载量。样本S1显示出最高的EBV-miRNA负荷，总EBV比对读取数为1421，而样本S6显示出中等丰度，读取数为273。所有其他样本的EBV-miRNA读取数均少于10个，这与低病毒拷贝数、有限的肿瘤细胞感染和转录受限的病毒状态一致。为了分类目的，EBV BART miRNA状态是使用互补的定性和定量标准定义的。EBV BART miRNA阳性是指通过RT-qPCR检测到至少一种EBV BART miRNA的表达高于分析检测阈值，并在标准化到内参对照后在技术重复中得到确认。EBV BART miRNA高是基于测序的丰度定义的，是指EBV BART miRNA读取在接头修剪、质量过滤和文库标准化后构成总小RNA测序读取的≥0.001%的样本。不满足这些标准的样本被指定为EBV BART miRNA低/阴性。这些操作定义被一致应用于所有下游分析和图表，以确保方法学的一致性和可重复性。在所有EBV-miRNA阳性样本中，表达谱的特征是高读计数的miRNA占主导地位。该表达模式与在EBV相关GC中通常观察到的潜伏期I型或II型转录程序一致。
3.3. 通过RT-qPCR验证EBV-miRNA表达
对小RNA测序识别的最丰富的EBV BART miRNAs进行了RT-qPCR验证，包括miR-BART19-3p、miR-BART1-5p、miR-BART10-3p、miR-BART6-3p、miR-BART13-5p和miR-BART22。测序定义的EBV阳性肿瘤显示出这些miRNA的稳健表达，而EBV低或阴性肿瘤在整个组中表现出低或不可检测的水平。RT-qPCR丰度模式与测序数据一致，证实了病毒miRNA谱的可重复性。基于通过RT-qPCR同时检测到多个EBV BART miRNA，21个GC样本中的8个（38.1%）被归类为EBV阳性，而13个样本（61.9%）被归类为EBV低/阴性。EBV阳性样本一致显示出miR-BART19-3p和miR-BART10-3p与其他BART miRNA的共表达，这与潜伏期相关的EBV-miRNA表达谱一致。
3.4. 计算机预测EBV BART miRNA宿主靶点及qPCR验证
为了识别本队列中检测到的EBV BART miRNAs可能靶向的宿主基因，使用ViRBase进行了病毒-宿主相互作用分析。分析仅限于在肿瘤样本中鉴定出的EBV BART miRNAs，包括BART1-5p、BART6-3p、BART10-3p、BART13-5p、BART19-3p和BART22。
ViRBase分析确定了多个与肿瘤抑制、细胞凋亡和细胞周期调控相关的预测宿主靶点。其中，PTEN被确定为miR-BART19-3p的预测宿主靶点（相互作用评分0.9489）。BCL2L11 (BIM) 被确定为BART1-5p的预测宿主靶点（评分0.963）。FOXO3和CDKN1A (p21) 被确定为与检测到的EBV BART miRNA集合相关的预测宿主靶点，相互作用评分分别为0.8899。这些靶点基于相互作用的置信度分数以及在ViRBase中被注释为细胞凋亡和细胞周期控制调节因子，被选用于下游表达分析。
根据计算机靶点识别结果，对GC样本中的PTEN、BCL2L11、FOXO3和CDKN1A进行了RT-qPCR分析。在EBV BART miRNA阳性肿瘤中检测到PTEN的表达低于EBV低/阴性样本。类似地，BCL2L11 (BIM) 的转录水平在EBV BART阳性肿瘤中降低。在EBV BART阳性样本中，相对于EBV低/阴性病例，也观察到了FOXO3和CDKN1A (p21) 的表达降低。对于所有四个靶点，每组内均观察到样本间的变异性；然而，总体表达模式在EBV BART miRNA阳性和EBV BART miRNA低/阴性肿瘤之间持续存在差异。这些结果证实了在ViRBase中预测的宿主靶点在EBV BART miRNA状态不同的本队列中存在差异性表达。
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讨论
EBV基因组多样性，由病毒亚型和进化历史塑造，对于理解上皮恶性肿瘤中病毒基因表达的毒株依赖性调控具有重要意义。大规模的EBV全基因组测序研究表明，EBV多样性的主要轴心由经典的1型和2型分类定义，主要由EBNA2和EBNA3基因座的序列差异驱动，其中1型毒株根据地理起源有进一步的亚结构。实验研究进一步表明，BART区域内的序列改变会影响EBV编码的miRNA的加工效率和丰度，这表明病毒基因组结构在塑造EBV-miRNA输出方面起着关键作用。EBV基因组组织的这些特征为解释本研究中在患者肿瘤中观察到的EBV-miRNA输出的变异性提供了重要框架。
在这项针对21个胃癌肿瘤的研究中，小RNA测序识别出一种在患者间存在差异性表达的保守EBV BART miRNA谱。一组核心的BART miRNAs，包括miR-BART19-3p、miR-BART1-5p、miR-BART10-3p、miR-BART6-3p、miR-BART13-5p和miR-BART22，在EBV-miRNA高的肿瘤中主导了EBV-miRNA景观。这些BART miRNA在同一肿瘤样本中被同时检测到高水平，表明存在共享的表达谱而非孤立的miRNA激活。这种多变量的EBV BART特征与来自东亚和欧洲的独立EBVaGC队列中报告的特征密切相关，其中相同的BART miRNAs持续位居最丰富的病毒小RNA之列。这种核心BART集合在不同人群中的可重复性支持存在一种保守的EBV潜伏程序，其特征是在胃上皮环境中优先表达BART。
值得注意的是，本队列中EBV-miRNA高的肿瘤出现在不同的解剖位置和Lauren分型中，这强化了EBVaGC代表一个分子定义的亚组而非临床病理学上统一实体的概念。重要的是，本研究中识别的几种主要BART miRNA在之前的实验研究中已被证明集中于与GC进展直接相关的通路。miR-BART10-3p和miR-BART22分别通过抑制DKK1和APC激活经典的Wnt/β-catenin信号通路，从而增强EBV相关上皮模型中的增殖和侵袭表型。miR-BART19-3p通过靶向WIF1、NLK和GADD45B进一步增强了Wnt信号传导和应激适应程序，而miR-BART6-3p则通过靶向DDX58 (RIG-I) 抑制先天免疫感知，减弱干扰素反应并促进免疫逃逸。
为了在本队列中将病毒miRNA谱与宿主信号状态联系起来，使用ViRBase进行了计算机病毒-宿主相互作用分析，该数据库整合了实验支持和高置信度预测的miRNA-靶点关系。在检测到的BART miRNAs中，PTEN被注释为miR-BART19-3p的预测靶点，BCL2L11 (BIM) 被注释为BART1-5p的预测靶点。FOXO3和CDKN1A也被注释为与主要BART种类相关的预测宿主靶点。选择这些基因进行RT-qPCR验证，以提供对个体肿瘤中宿主通路参与情况的直接测量。
优先考虑PTEN、FOXO3、CDKN1A和BCL2L11得到了大量文献的支持，这些文献将这些节点与EBVaGC的分子特征联系起来。PTEN是PI3K–AKT信号传导的核心调节因子，PTEN表达的缺失在EBV阳性GC中常有报道，常与PIK3CA改变和磷酸肌醇通路激活同时发生。包括PTEN启动子在内的肿瘤抑制位点的甲基化介导的抑制已在EBVaGC中被描述，这与EBV相关疾病中广泛存在的表观遗传重编程的报道一致。FOXO3和CDKN1A整合了应激和DNA损伤反应信号，而BCL2L11则调控线粒体凋亡。先前的研究已将EBV编码的miRNA与EBV相关恶性肿瘤中BCL-2家族成员和凋亡阈值的调控联系起来。
至关重要的是，本队列患者间的EBV-miRNA丰度存在差异，表明EBV BART特征捕获了分子水平上的EBV活性维度，而这并不能通过二元EBV状态单独反映。这种异质性表明肿瘤间病毒调控活性存在差异，而非所有EBV阳性病例具有统一的EBV转录输出。EBV阳性肿瘤中存在不同的EBV-miRNA表达模式，允许进行更精细的分子分层，并有助于将病毒调控活性与肿瘤进展相关的宿主通路改变直接联系起来。考虑到临床研究报告了EBV阳性胃癌亚群中更高的PD-L1表达和独特的转移行为，这一点尤其重要。与这些独立临床研究中的发现一致，EBVaGC在选定的患者队列中对免疫检查点抑制表现出了具有临床意义的反应。宿主基因相互作用是使用经过筛选的预测资源和表达一致性分析来推断的；直接的miRNA-靶点结合和下游调控机制实验验证超出了本研究的范围。
综上所述，我们的研究表明，胃癌中的EBV阳性包含一个在患者水平上可重复和可量化的EBV BART miRNA特征。将病毒miRNA丰度与宿主基因在PTEN、FOXO3、CDKN1A和BCL2L11中的靶向表达测量相结合，定义了一种分子EBV特征，该特征在单个肿瘤样本中是可追踪的。这个特征反映了对PI3K信号、凋亡调控、细胞周期控制和应激反应通路的协同参与，这些通路与EBVaGC的肿瘤进展和治疗敏感性直接相关。
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结论
通过识别一致的EBV BART miRNA模式并将其与人类肿瘤中可量化的宿主基因表达变化联系起来，本研究在队列规模和功能验证的局限范围内，提供了一个用于评估胃癌中EBV相关调控活性的患者水平分子框架。将EBV BART miRNA谱与生物学相关的宿主靶点整合，表明它们有潜力作为功能性生物标志物和EBV相关疾病中通路参与的指标。未来在更大队列中进行的研究，若能包含EBV基因组变异、宿主遗传背景和纵向临床随访，将有助于阐明EBV来源的miRNA对胃癌及其进展的贡献。
