禽类疾病对全球养殖业构成了重大挑战，不仅影响其经济效益，还带来潜在的公共卫生和安全风险。常见的禽类疾病包括禽流感（AI）、新城疫（ND）、传染性喉气管炎（ILT）、传染性支气管炎（IB）和禽痘（FP）等。这些病原体传播迅速，临床表现不典型，现有的诊断技术耗时且通量低，使得诊断极其困难。禽流感是最为人所知的禽类疫情之一，尤其是高致病性禽流感（HPAI）病毒，如H5N1和H7N9，它们导致了严重的家禽损失，并存在传播给人类的风险，引发公共卫生和安全问题。近年来，H5N1的一个新变种H5N1（分支2.3.4.4b）在欧洲、美国和亚洲的禽类中爆发，并从禽类传播到多种哺乳动物（Wanyi等人，2025a）。自2024年3月以来，高致病性H5N1禽流感变种（分支2.3.4.4b）在牛群中传播并导致人类感染。根据美国疾病控制与预防中心的最新数据，该病毒已在美国16个州的牛群中被发现，且在多次牛奶样本中检测到感染性病毒（Lifei和Shanni，2025）。NDV与AI一样，是一种由病毒引起的急性呼吸道感染，两者均被列为进口到中华人民共和国的动物检疫疾病名单中的第一类疾病。FPV的黏膜型病变容易与ILTV混淆，因此临床诊断需要依赖分子分型。此外，FAdV和AMPV的免疫抑制作用可能会加剧其他病毒在家禽中的致病性（Esther等人，2008；Tsunekuni等人，2017）。在禽类疾病暴发期间，由于大量家禽被强制扑杀，农场可能会遭受重大经济损失。同时，贸易和出口可能会受到限制，影响社会稳定。因此，建立一种快速、高通量的多目标检测方法至关重要。
近年来，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已成为分子诊断领域的重要工具，主要用于基因分型（Ren等人，2025）、突变检测（Medical Oncology等人，2018）、微生物鉴定（J等人，2014）和药物基因组学检测（Shujuan等人，2020），因为它具有高通量、快速和灵敏度的优势。MALDI-TOF质谱（Hong等人，2014）通过PCR扩增目标序列并结合碱基特异性消化或延伸反应来检测核酸片段的质量差异，并利用MALDI-TOF质谱实现高精度的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失和甲基化分析。大约在2000年，研究人员主要关注如何使用MALDI-TOF质谱检测短序列（Banoub等人，2005）。随后Sequenom公司推出的MassARRAY系统（Christian等人，2004）推动了这项技术的临床应用，将其从传统的基因组分析扩展到临床诊断和病毒基因组研究等领域，成为快速筛查病原体和突变位点的重要工具。多重核酸分析技术的出现也使得MALDI-TOF能够在短时间内实现多重病原体检测，且无需大量试剂和复杂操作。该技术在检测结核分枝杆菌（Division of Clinical Microbiology等人，2015）、猪源病毒（Zhiqiang等人，2025）和牛源病毒（Jiangbing等人，2025）等病原微生物方面被证明是准确有效的，为混合感染的鉴定、病原体分型和临床应用提供了更多便利，提高了效率和准确性。
在本研究中，基于MALDI-TOF质谱和多重PCR技术，我们建立了一种多重检测方法，用于同时检测这10种常见禽类病原体，包括AIV的三种亚型H5/H7/H9，以及通用类型的NDV、ILTV、IBV、FPV、FAdV和AMPV，为禽类疾病的早期诊断、预防和控制提供了新的解决方案。
