1. 引言
在水产养殖中，实现最佳生长是关键目标，适当的饲养实践至关重要。在持续的投喂方案下，鱼类生长高效并能积累能量储备。然而，在饲料限制期间，这些储备会被调动以满足基本生存需求。值得注意的是，短期禁食可以作为水产养殖中的一种战略性管理工具，有助于解决水质问题、缓解温度波动的影响，并减轻与收获前和处理操作相关的应激。
禁食和随后的再投喂方案为基础和应用研究提供了宝贵见解。禁食会触发分解代谢的转变，导致生长率下降。相比之下，再投喂会引发高合成代谢反应，促使鱼类加速生长以进行补偿。食欲亢进是补偿性生长的主要机制，先前禁食的鱼类会增加自愿摄食量以恢复损失的体重和能量储备。这种禁食后食欲的增加，通常受到促食欲信号的内分泌调节支持，提高了饲料利用效率，并促进了几种鱼类的追赶生长。补偿性生长的程度，由禁食后鱼体重的恢复决定，可分为过度补偿、完全补偿、部分补偿或无补偿。然而，补偿性生长可能不会在所有生长参数中统一表现，因为先前的研究表明，鱼类可能在不按比例恢复体长的情况下补偿损失的身体质量，表明存在参数特异性的生长反应。在因禁食导致生长抑制后，鱼类通常在恢复有利的饲养条件时表现出补偿性生长。这种加速生长可能超过持续喂养的对照鱼，并可能由摄食量增加、促有丝分裂活性和饲料转化效率提高所驱动。
禁食和再投喂会显著改变基因表达模式，这可能影响肌肉代谢和生长速率，在某些情况下，可能损害肌肉发育。在硬骨鱼中，骨骼肌的维持和生长在很大程度上取决于营养物质的可用性。这进而调节生长激素/胰岛素样生长因子1（GH/IGF1）轴，这是一个调节营养代谢、肌肉蛋白质合成和各种组织生长的关键激素通路。IGF-I是通过自分泌和旁分泌途径起作用的主要促有丝分裂多肽，被广泛认为是评估鱼类生长的首要生物标志物。其在刺激蛋白质合成和促进肌肉肥大方面的作用，使其成为生长性能的有力指标。
肌肉生长受多种基因调控，值得注意的是肌肉生长抑制素（MSTN），它是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的一员，是骨骼肌发育的强效抑制剂。其作为负调控因子的作用在脊椎动物中高度保守，强调了其在控制肌肉生长和发育中的关键重要性。此外，研究表明，禁食可降低多种器官中的抗氧化储备，并增加氧自由基的产生，其中肝脏受到的影响最为显著。
近年来，益生菌在水产养殖中的应用受到了极大关注。益生菌是活的有利微生物，已被证明可以增强营养吸收、调节肠道微生物群并增强免疫反应，所有这些在饲料剥夺后的恢复期都至关重要。例如，对尼罗罗非鱼和其他水产养殖物种的研究证实，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母等益生菌可显著提高生长性能、饲料转化效率和氧化应激抗性。
尽管益生菌在水产养殖中的益处已被广泛研究，但它们在禁食后再投喂阶段的具体作用，特别是在尼罗罗非鱼中，受到的关注有限。现有的大多数研究探讨益生菌在一般饲养方案、抗病性或生长促进中的作用，而不是专门针对禁食后再投喂，这留下了在理解益生菌如何影响饲料剥夺后的生长恢复效率和氧化应激恢复效率方面的空白。填补这一空白可以为优化再投喂策略和增强养殖罗非鱼的恢复力提供新的见解。因此，本研究旨在评估短期禁食后益生菌补充对尼罗罗非鱼恢复效率的影响。具体而言，我们调查了再投喂期间的益生菌是否可以改善生长性能、肌肉组织的组织学变化以及关键应激和生长相关基因的表达。通过将生长指标与组织和基因水平分析相结合，本研究试图找到一种支持快速恢复和持续生长的饲养策略。
2. 材料与方法
2.1. 饲料制备
实验期间，尼罗罗非鱼接受两种不同的日粮处理。第一种处理是使用Skretting（埃及Nutreco公司）为罗非鱼特制的商品配合饲料作为基础日粮。该饲料含有30%粗蛋白、6%粗脂肪和5.22%粗纤维。第二种处理是益生菌强化日粮，通过向基础饲料中添加市售的冻干益生菌混合物（Sanolife® PRO-F，INVE Aquaculture，泰国）制备。该混合物含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，总浓度不低于1 × 109 CFU/g，按1 g/kg饲料的比例添加。将益生菌混合物制备成水悬液，先在无菌蒸馏水中均质，然后均匀喷洒在饲料上以确保表面涂层均匀，随后在室温（25 ± 2 °C）下风干以去除多余水分并稳定涂层。在饲料添加前，通过营养琼脂平板计数确认益生菌细胞的活力，确保活菌数量与制造商规格一致。在涂层和干燥后收集代表性饲料样品，并重复细菌计数以验证补充日粮中的均匀分布和活力。制备好的日粮储存在4°C的密闭容器中备用。
2.2. 鱼源和驯化
尼罗罗非鱼购自埃及基纳省的一个商业渔场。鱼被运送到基纳大学水生生物医学系的湿实验室，在受控环境条件下进行为期两周的驯化。定期监测水质参数，包括溶解氧（5.7 ± 0.7 mg/L）、温度（25.5 ± 0.6 °C）、pH（7.2 ± 0.3）和总氨氮（<0.07 mg/L）。在此阶段，所有鱼均仅饲喂基础日粮。
2.3. 实验设计
驯化后，将180条健康的尼罗罗非鱼（初始平均体重37 ± 1.8 g）随机分配到九个玻璃纤维水箱中，每箱20条鱼。这些水箱分为三个处理组，每组三个重复：
• 第1组（对照组）：鱼连续20天饲喂基础日粮。
• 第2组（禁食/基础日粮再投喂组）：鱼经历5天禁食期，随后用基础日粮再投喂15天。
• 第3组（禁食/强化日粮再投喂组）：鱼经历相同的5天禁食期，随后用添加了商业益生菌制剂的基础日粮再投喂15天。
在再投喂阶段，鱼按体重3%/天的固定比例投喂，并根据生物量进行调整。这种标准化的投喂确保了各组之间的饲料供应相等，但不允许随意采食。因此，该设计控制了饲料投入，同时可能限制了与补偿性生长相关的自然食欲亢进反应。
鱼每天人工投喂两次。所有水箱在相同的环境条件下饲养，包括水温25.8 ± 0.5 °C，溶解氧6 ± 0.6 mg/L，pH 7.2 ± 0.3，总氨氮 < 0.07 mg/L，光周期12L:12D。定期监测水质参数以确保鱼类健康和生长的最佳条件。
2.4. 生长性能指标和饲料利用
在实验开始（第0天）、禁食后5天和再投喂后15天，每个水箱取样6条鱼（每组总n = 18条鱼），随机选取并用丁香酚过量安乐死。分别测量每条鱼的体重（g）和总长（cm）。这些生物测定数据用于计算生长性能和饲料利用参数。此外，在实验结束时使用公式计算存活率：存活率（%）= 最终鱼数/初始鱼数 × 100。每天记录死亡率，并在试验结束时统计每个水箱中存活鱼的数量。数值以初始放养密度的百分比表示。
2.5. 组织取样
在实验开始（第0天）、禁食后5天和再投喂后15天收集肌肉样本。取样来自三个组（n = 3/组，1条鱼/重复水箱）体轴背侧区域。样品保存在RNA-later中，冷藏过夜，然后在-80°C冷冻以保存RNA完整性。另一组肌肉组织（n = 3/组）保存在10%福尔马林中用于组织形态学分析。
2.6. 基因表达分析
2.6.1. RNA提取和cDNA合成
使用RNeasy® Mini Kit（Qiagen，德国）从每个肌肉组织样品（30 mg，n = 3/组）中提取总RNA，遵循制造商方案。使用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度和纯度。在cDNA合成前，通过评估A260/A280吸光度比并通过琼脂糖凝胶电泳观察核糖体RNA带来评估RNA完整性。使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific，美国）从1 μg总RNA合成第一链cDNA。所得cDNA储存在-20°C用于后续基因表达分析。
2.6.2. 实时定量PCR
本研究使用了尼罗罗非鱼基因特异性引物。以β-肌动蛋白基因作为内参基因来标准化基因表达数据。使用HERAPLUS SYBR Green qPCR Kit进行实时定量PCR。通过标准曲线分析确定的引物效率在90%到100%之间。通过熔解曲线分析确认扩增特异性，显示单一峰谱，并通过PCR产物测序进一步验证。
PCR方案的热循环条件包括：95°C初始变性3分钟，然后进行40个扩增循环，每个循环包括95°C变性10秒和60°C退火/延伸1分钟。在qPCR反应的延伸阶段监测荧光信号。为确保扩增特异性并排除污染的可能性，所有反应中都包含无模板对照。测定每个样品的循环阈值，并使用2-ΔΔCt 方法计算相对基因表达水平。
2.7. 组织学检查
从三个组（n = 3/组）的背侧区域（从头到尾）收集肌肉组织。每组分析三个横截面，每组总共3条鱼（n = 3/组）。对于每个横截面，进行三次测量，从而获得综合数据集。从这些测量中计算每个参数的平均值，以便更细致地理解数据。
将样品切成小块（3-5 mm）并在10%中性缓冲福尔马林中固定48小时。通过梯度乙醇系列（70%、80%、90%和100%）进行组织脱水，随后在65°C进行石蜡包埋。使用Leica旋转切片机获取纵向和横向骨骼肌切片（3-4微米），并用苏木精和伊红染色用于组织形态学评估。使用ImageJ软件分析白肌纤维横截面图像，以确定肌纤维横截面积、纤维直径和肌纤维之间的肌内膜间隙直径。
使用ImageJ软件中的自由选择工具测量横截面积，并自动计算面积。同时，测量每个纤维的纤维直径以适应其多面体形状。此外，使用直线工具测量相邻肌纤维边界之间的距离来确定肌内膜间隙直径。每条鱼检查三个肌肉横截面。在每个截面内，选择五个不重叠的视野，每个视野测量三个随机选择的肌纤维。此采样策略旨在考虑纤维大小和形状的截面内变异性，同时最小化选择偏差。
2.8. 数据分析
使用GraphPad Prism进行统计分析和数据可视化。结果以均值±标准误表示。使用单因素方差分析和双因素方差分析评估组间差异，显著性阈值为p < 0.05。使用Tukey多重比较检验进行事后比较，以确定处理组之间的显著成对差异。
3. 结果
3.1. 生长性能指标和恢复反应
实验期间未记录到死亡。实验开始时，所有组表现出可比的体重和体长，无显著差异。经过5天禁食后，与持续喂养的对照组相比，两个禁食组的体重均出现显著降低，而体长变化不显著。然而，在15天再投喂阶段，恢复模式存在差异；基础日粮组未能实现体重的完全恢复，而保持与对照组相当的体长值。相比之下，饲喂益生菌强化日粮的鱼在体重和体长上表现出显著增加，超过了对照组和基础日粮组。
增重模式与各组体重变化密切相关。经过5天禁食后，与对照组相比，禁食组的增重显著降低。在15天的再投喂阶段，饲喂基础日粮的鱼增重显著增加，超过了对照组，但仍低于益生菌补充组。然而，益生菌强化组在所有组中实现了最高的增重。肥满度分析显示，在5天禁食和随后15天用基础日粮或益生菌补充日粮再投喂后，各组之间变化不显著。
在整个实验期间计算出的特定生长率在各处理之间无显著差异。尽管益生菌补充组的鱼表现出略高于对照组和基础日粮组的特定生长率值，但这些差异不显著。
与对照组相比，两个再投喂组的相对摄食量均显著降低。关于饲料利用，与对照组相比，两个组的饲料转化率均显著降低。此外，益生菌喂养组相对于基础日粮组的饲料转化率进一步显著降低。
3.2. 分子反应
经过5天禁食后，与对照组相比，基础日粮和益生菌补充组的抗氧化基因cat 和sod-2 均显著上调。用基础日粮再投喂将其表达恢复到与对照鱼相当的水平。相反，用益生菌补充日粮再投喂引发了两个基因的显著上调，超过了在对照组和基础日粮再投喂组中观察到的表达水平。
相反，生长相关基因igf-1 和soc-2 在5天禁食期后与对照组相比显著下调。再投喂导致两个饮食组相对于对照组的基因表达显著上调，其中益生菌补充日粮引发了最高的表达水平。
类似地，抗炎基因tgf-β 在禁食后显著下调。用基础日粮再投喂将其表达恢复到与对照组相当的基线水平，而益生菌补充则引起了显著的上调，超过了对照组和基础日粮再投喂组。
myostatin 基因在5天禁食后相对于对照组在两个饮食组中均显著上调。随后的再投喂，无论是用基础日粮还是益生菌补充日粮，都使其表达正常化，恢复到与对照组观察到的相当水平。
3.3. 组织学评估
3.3.1. 骨骼肌的组织形态学
第5天对照组尼罗罗非鱼的骨骼肌显示出正常的组织结构。在纵向切片中，肌纤维平行排列并表现出明显的横纹。在横截面中，横纹肌细胞呈多面体，细胞核位于外周，单个纤维被正常的肌内膜组织分隔。
相比之下，在禁食期间，基础日粮组和益生菌组在纵向和横截面视图中均显示出明显的结构改变。这些变化包括肌纤维尺寸减小、核固缩、血管周围炎症细胞浸润以及横纹肌细胞横纹消失。此外，还存在明显的肌原纤维降解、肌纤维间肌内膜间隙增宽以及肌束膜厚度显著增加。
第20天对照组罗非鱼的骨骼肌表现出正常的、具有明确横纹的多核纤维，表明肌原纤维排列有序。在基础日粮再投喂组中，肌肉形态显示出朝向对照状态的明显恢复迹象，包括肌原纤维含量的逐步恢复、横纹清晰度改善和间隙减少。
益生菌再投喂组显示出最显著的改善，其特征是肌纤维完整性增强和横纹模式清晰。该组的横纹肌细胞显示出肌原纤维密度显著增加，呈现出密集肌丝斑点，这种效应在红肌纤维中比在白肌纤维中更明显。此外，该组表现出更大的肌纤维直径和肌内膜间隙的显著减小。
3.3.2. 组织形态计量学分析
尼罗罗非鱼骨骼肌横截面的组织形态计量学评估揭示了实验组之间肌纤维结构的明显差异。第5天，对照组表现出465.02 μm2 的横截面积、20.80 μm的纤维直径和2.65 μm的肌内膜间隙，而两个禁食组均表现出明显的萎缩变化，横截面积和纤维直径显著减小。尽管肌内膜间隙增加，但这些变化不显著。横截面积的减少仍然反映了可测量的肌纤维萎缩和早期细胞外基质扩张。
到第20天，对照组显示出695.26 μm2 的横截面积、24.24 μm的纤维直径和2.67 μm的肌内膜间隙。基础日粮再投喂组表现出与对照组无显著差异的横截面积，但显示出显著更小的纤维直径和减少的肌内膜间隙，尽管后者不显著。相比之下，益生菌再投喂组显示出最大的结构恢复。该组表现出显著更大的横截面积和显著更紧凑的肌内膜间隙，表明肌纤维再生更优且细胞外基质扩张减少。
4. 讨论
本研究旨在评估在标准化饲养条件下益生菌补充对尼罗罗非鱼生长性能和恢复的影响。虽然补偿性生长通常以随意采食下的食欲亢进和加速恢复为特征，但我们的设计应用了固定比例以控制各组之间的饲料投入。这种方法使我们能够分离益生菌的日粮效应，但限制了自然补偿机制的表达。因此，结果反映了标准化饲养条件下的恢复效率，而不是完全的补偿性生长。
禁食组体重和增重的显著减少反映了营养剥夺期间的典型生理反应，其中能量储备被调动以维持基础代谢和必要的代谢过程。这种分解代谢状态导致躯体生长和体重的减少。先前的研究表明，鱼类的生长性能强烈依赖于营养状态，并且主要由骨骼肌发育驱动。在大西洋鳕鱼中，禁食显著降低了肥满度、肌肉代谢能力和耐力性能，其中白肌特别受到营养剥夺的影响。禁食改变了肌肉能量代谢并降低了与生长相关的生理性能，突出了肌肉组织是禁食应激的关键靶点。类似地，在鲤科鱼类中的研究表明，生长反映了肌肉、骨骼和脂肪组织的协调发育，其中肌肉是蛋白质保留的主要部位。营养条件显著影响肌肉结构、形态特征和组织结构，从而塑造整体生长性能。
在这项研究中，再投喂后，两个禁食组之间出现了不同的恢复模式，表明在基础日粮喂养组的情况下，再投喂持续时间不足以完全恢复。饲喂基础日粮的鱼表现出不完全恢复，这从它们持续较低的体重可以证明。重要的是，所有再投喂组都接受了标准化的日粮（体重的3%/天），确保了组水平的饲料供应相等。虽然这证实了饲料在实验上是受限制的，但由于摄食期间的行为互动，个体摄入量可能有所不同。基础日粮组观察到的较低体重很可能反映了再投喂期间的不完全生理恢复和养分利用效率降低，而不是饲料供应不足。这表明，再投喂的持续时间虽然足以启动恢复，但在标准日粮条件下不足以完全恢复体重。类似的结果被报告，他们观察到短期禁食后再投喂并未能完全恢复尼罗罗非鱼的生长参数，突出了再投喂持续时间和营养质量的重要性。此外，在欧洲海鲈鱼中也记录了不完全的补偿性生长。
相比之下，益生菌补充组在所有生长指标中表现出更优的性能。这些鱼在体重、体长和增重方面表现出显著的反弹，超过了基础日粮组和持续喂养组，同时在相同的饲养方案下保持了与持续喂养组相当的肥满度，表明在再投喂期间生长性能有所改善。这些结果表明，日粮益生菌可能支持短期禁食后的恢复，可能通过增强营养吸收、调节肠道微生物群和改善消化酶活性等机制。
两个再投喂组的肥满度均保持在对照水平，这表明鱼类在禁食后能够恢复其身体状况。这表明再投喂期足以恢复体重-体长平衡，尽管处理之间的生长性能差异仍然存在。相似的肥满度值意味着成功的生理恢复，而在益生菌组中观察到的更优生长指标可能反映了增强的养分利用而不是身体状况的差异。
为整个实验期间计算的特定生长率在各组之间没有显著差异。然而，益生菌喂养组与其他组相比在数值上表现出更高的特定生长率。这种趋势表明益生菌在恢复期间对改善生长性能可能有支持作用，尽管在当前实验条件下该效应不显著。整体特定生长率值的相似性表明，禁食期间的生长抑制是暂时的，并且在再投喂期间在很大程度上得到了补偿，导致各组之间具有可比的整体生长轨迹。
此外，两个组的相对摄食量均显著降低，但生长性能，尤其是在益生菌组中，仍然很高。这种降低表明，先前禁食的鱼类在再投喂阶段相对于其体重消耗了更少的饲料，提高了养分同化和代谢效率，这是有效补偿性生长的一个标志。这些发现得到了支持，他们观察到再投喂的罗非鱼改善了饲料效率和与生长相关的基因表达。
有趣的是，与对照组相比，两个组的饲料转化率均显著较低，表明在再投喂期间饲料效率提高。这种改善可能反映了一种代偿性生理反应，即先前禁食的鱼类更有效地利用养分以支持快速的组织再生和生长。这些发现与补偿性生长的概念一致，即营养缺乏的动物在再投喂时表现出改善的饲料效率，作为其恢复策略的一部分。此外，已知益生菌可以通过改善消化和营养吸收来对抗应激相关的生长抑制，从而改善饲料转化率。
水生动物拥有一个对抗氧化应激的生理防御系统，包括非酶抗氧化剂和酶成分，如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶。禁食5天后cat 和sod-2 的显著上调表明尼罗罗非鱼在营养剥夺下氧化应激增强，并反映了抵消禁食应激期间产生的活性氧的代偿机制。这与先前的发现一致，即禁食会诱导氧化应激，从而刺激褐鳟和西伯利亚鲟的抗氧化防御机制。类似的研究报告了在杂交石斑鱼和草鱼短期禁食期间抗氧化酶活性增加，其中饥饿改变了非特异性免疫参数和抗氧化状态。
用基础日粮再投喂将基因表达恢复到对照水平，表明一旦恢复营养供应，抗氧化系统迅速恢复稳态，反映了氧化 应 激 负 担 的
打赏
