引言
蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia, syn. intestinalis, duodenalis）是导致贾第虫病（Giardiasis）的原虫性肠道寄生虫，每年造成约3亿例水传播性腹泻病例，是医疗卫生服务不足地区，特别是幼儿健康的重大威胁。该病的传播和诊断关键体是其环境抵抗形式——包囊。目前，贾第虫病的诊断主要依赖于经典的光学显微镜粪便检查，但该方法常不充分，需辅以基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的粪便抗原检测，后者使用由Waterborne公司授权、价格昂贵的专利性抗包囊壁蛋白1（CWP-1）单克隆抗体（Mab）。这种昂贵的试剂在贾第虫病高发的资源有限地区往往难以负担，严重制约了诊断的普及。
为应对医疗公平性问题，并探索研究贾第虫包囊壁的新策略，本研究致力于开发并表征由羊驼免疫获得的、靶向贾第虫包囊壁制备物的单域抗体，即纳米抗体（Nabs）。纳米抗体是源自骆驼科动物特殊单链抗体的特异性可变结构域（VHH，约14 kDa），具有体积小、稳定性高、易于在大肠杆菌（E. coli）中低成本重组表达和规模化生产等优势。本研究成功获取了十二个独特的纳米抗体序列，并系统评估了它们用于贾第虫包囊壁检测的有效性和结合能力。
生成与克隆十二个独特的纳米抗体序列
研究团队通过免疫羊驼，使用经过充分洗涤以去除非壁污染物的碎片化贾第虫包囊壁悬液作为抗原。监测显示抗体应答谱中IgG2和IgG3抗体富集。利用外周血淋巴细胞cDNA扩增VHH序列库，克隆至噬菌粒载体并在丝状噬菌体上展示。通过对固定化抗原片段进行阳性结合子筛选，最终获得了13个对碎片化包囊壁具有高亲和力的纳米抗体序列家族。这些序列被克隆至适合在大肠杆菌中阿拉伯糖诱导表达的载体，以可切割的HA标签融合蛋白形式（与10×His标签的麦芽糖结合蛋白MBP融合）靶向周质空间表达。
纳米抗体的表达、固定与蛋白酶解
对十二个克隆的纳米抗体融合构建体进行诱导表达测试，发现Nab 128和Nab 138存在缺陷（前者HA标签编码区缺失，后者存在已知有害稳定性的突变）而未进一步研究，其余十个序列成功表达。成功表达的HA标签纳米抗体融合蛋白经周质提取后，固定在抗HA琼脂糖珠上。随后，直接使用人鼻病毒3C（HRV-3C）蛋白酶处理，以释放纳米抗体的N末端，这是实现高效抗原结合所必需的步骤。免疫印迹分析证实了HA标签纳米抗体在珠上的有效固定以及HRV-3C蛋白酶对MBP融合伴侣的高效切割与释放。
纳米抗体介导的免疫沉淀与靶标鉴定
将N末端可及的纳米抗体修饰珠用于对非成囊和成囊贾第虫细胞提取物进行免疫沉淀（IP），并结合液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析。结果表明，除Nabs 127和137外，所选纳米抗体几乎特异性地识别成囊相关抗原，如包囊壁蛋白（CWPs）和高半胱氨酸非变异包囊蛋白。与从非成囊提取物中相比，从成囊提取物中免疫沉淀出的这些抗原富集了数倍。相比之下，无纳米抗体对照（质粒139）则捕获了多种低亲和力结合物，且无抗原偏好性。
纳米抗体在免疫印迹中的检测能力
尽管纳米抗体通常在识别天然表位时表现最佳，但在变性条件下（如免疫印迹）的检测能力有限。本研究测试了纳米抗体在变性条件下检测抗原的能力。将成囊贾第虫细胞提取物进行变性凝胶电泳、转膜，并将硝酸纤维素膜条分别与各纳米抗体生产菌的周质提取物（经HRV-3C处理）孵育。通过抗HA标签检测发现，只有Nabs 126、127、130、133以及较弱的134，能够像当前贾第虫包囊检测金标准——抗CWP-1单克隆抗体一样，检测到变性抗原。进一步的时间过程分析显示，Nabs 126、130和133的结合谱与抗CWP-1单克隆抗体相似，而Nab 127的结合谱明显不同，提示其检测的抗原在成囊过程中可能被加工。
确定Nabs 126、127、130和133的确切CWP结合靶点
为更严谨地确定上述四个纳米抗体的确切结合靶点，研究团队构建了用于重组CWP表达的大肠杆菌菌株。将编码CWP-1、CWP-2、CWP-3以及CWP-2的截短变体（CWP2-N和CWP2-C）的开放阅读框克隆至表达载体。诱导表达后，通过免疫印迹和Ni-NTA珠捕获验证了重组蛋白的表达与可溶性。随后，测试了琼脂糖珠固定的Nabs 126、127、130和133从含CWP的周质提取物中下拉靶抗原的能力。结果显示，所有四个选定的纳米抗体都能特异性结合CWP-1-His，其中Nab 127还能额外结合CWP-2-N-His，而在相应的无纳米抗体对照反应中未检测到结合。
纳米抗体在免疫荧光检测中的应用
为进一步验证纳米抗体作为检测工具的有效性，研究测试了表达Nabs 126、127、130和133的大肠杆菌周质提取物在免疫荧光实验（IFA）中对固定、透化的非成囊、成囊贾第虫细胞及体外生成包囊的标记能力。共聚焦荧光显微镜显示，这些选定的纳米抗体与抗CWP-1单克隆抗体类似，能特异性标记成囊细胞和包囊，而在相同条件下均不标记非成囊细胞样本，证实了它们对包囊壁抗原的选择性。
纳米抗体的功能化衍生及在临床参考样本中的应用
为使纳米抗体更适用于诊断场景，简化工作流程，研究将Nab 133与荧光染料HiLyte Fluor 488直接偶联，得到Nab 133-HF488。概念验证实验表明，Nab 133-HF488能够以约2 µg/ml的终浓度结合体外生成的贾第虫包囊悬液。为评估其在复杂背景下的检测能力，研究进一步在十份随机挑选的、经福尔马林保存的人临床参考粪便样本中测试了Nab 133-HF488的性能。这些样本已通过常规诊断显微镜检查预先判定为阳性或阴性。荧光显微镜检查显示，Nab 133-HF488能正确识别所有阳性样本，在含有大量碎片和其他污染物的复杂临床样本中有效检测贾第虫包囊，且背景信号极低。盲法测试结果与常规诊断结果完全一致。
讨论与结论
腹泻病仍是五岁以下儿童死亡的主要原因之一，而贾第虫病作为一种全球性水传播腹泻病，其诊断工具的普及至关重要。当前依赖昂贵专利单克隆抗体的现状，限制了资源有限地区的诊断可及性。纳米抗体以其低成本、易于生产、无需动物牺牲等优势，为诊断和研究的资源民主化提供了巨大潜力。
本研究成功开发了十二个针对贾第虫包囊壁的独特纳米抗体序列，其中十个可在大肠杆菌中成功表达。这些纳米抗体被证明是检测成囊特异性抗原及贾第虫包囊壁主要蛋白成分（CWP-1/3和CWP-2）的有效工具。特别地，其中四个纳米抗体（126, 127, 130, 133）在变性（免疫印迹）和非变性（免疫荧光）条件下均表现出良好的结合能力。选择Nab 133进行直接荧光标记，并在复杂临床样本中成功验证了其检测能力，为替代昂贵的专利抗体提供了概念证明。
尽管本研究存在临床样本量较小的局限性，但其结果明确展示了纳米抗体作为经济高效、可扩展的检测工具的潜力。未来工作将探索这些纳米抗体在侧流免疫层析检测中的应用，并测试其在混合感染样本中的稳健性。总之，本研究提出了一种符合3R原则（减少、优化、替代动物使用）、可促进医疗诊断公平性的纳米抗体生产与应用工作流程，为贾第虫病乃至其他寄生虫病的诊断提供了新颖且有前景的解决方案。
