蒙西查·尼贾兰（Monsicha Nijaran）、西蒂鲁克·罗伊特拉库尔（Sittiruk Roytrakul）、纳鲁蒙·法奥纳克罗普（Narumon Phaonakrop）、安皮卡·通帕克迪（Ampika Thongphakdee）、伊蒂·布诺拉纳（Itti Boonorrana）、苏帕拉克·基阿特松布恩（Supalak Kiatsomboon）、桑蒂塔·卡鲁恩（Santhita Karoon）、古纳蓬·苏里亚帕波尔（Gunnaporn Suriyaphol）
泰国曼谷朱拉隆功大学（Chulalongkorn University）兽医学院生理学系生物化学单元
摘要 受精的成功在很大程度上取决于精液的质量。然而，精液的冷冻保存会损害精子的功能并降低受孕率，从而阻碍包括埃尔德鹿（Rucervus eldii ）在内的濒危物种的种群恢复。尽管这一点非常重要，但关于冷冻保存对埃尔德鹿精子蛋白质组成影响的研究仍然有限。本研究使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，分析了暹罗埃尔德鹿和缅甸埃尔德鹿在新鲜状态、冷冻前状态和解冻后状态下的精子蛋白质组谱。比较分析显示，不同阶段的蛋白质表达模式存在显著差异。共鉴定出2294种蛋白质，其中16种在新鲜精子与冷冻前精子之间、14种在新鲜精子与冷冻保存后的精子之间存在显著差异。冷冻前精子中卷曲结构域蛋白136（CCDC136）和信号转导及转录激活因子3（STAT3）的水平升高，表明细胞骨架在冷却过程中得到了稳定，同时免疫系统也被激活。解冻后的精子中核苷二磷酸激酶A（NME1）和锌指蛋白类似物1（ZFPL1）的水平降低，表明代谢和染色质结构发生了改变；而cullin-4B（CUL4B）和小型泛素样修饰蛋白1（SUMO1）的水平升高，则反映了DNA修复和蛋白质周转途径的激活。这些分子变化与解冻后精子活力、存活率以及膜和顶体完整性的下降相一致，突显了关键的应激反应机制。所鉴定的蛋白质可作为精液质量评估的生物标志物，并为优化冷冻保存策略提供依据，从而支持埃尔德鹿的保护工作。
引言 埃尔德鹿（Rucervus eldii ）是一种原产于东南亚的偶蹄类动物，由于栖息地丧失、栖息地破碎化以及狩猎等原因，其种群数量急剧下降，被国际自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种[1]。小型且孤立的种群面临遗传多样性降低和近亲繁殖的风险，这进一步威胁了其长期生存[2]。该物种也被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）的附录I，限制了非商业用途的国际贸易[3]，并在泰国的《野生动物保护法》（B.E. 2562，2019年）中受到法律保护[4]。 为了帮助濒危物种的恢复，辅助生殖技术（ARTs）被越来越多地应用于提高繁殖成功率并维持遗传多样性。在埃尔德鹿的研究中，诸如发情同步、宫内人工授精（AI）和使用冷冻-解冻精液的体外受精（IVF）等ARTs在圈养繁殖计划中取得了有希望的结果[5]、[6]。这些技术的关键组成部分是精液冷冻保存，它能够长期保存宝贵的遗传物质并支持先进的生殖干预措施。然而，极端冷却和解冻条件会导致氧化应激、膜不稳定、线粒体功能障碍、顶体损伤和细胞凋亡，最终降低解冻后精子的生育能力[7]。
保护性添加剂在减轻冷冻引起的损伤方面显示出潜力。例如，据报道表皮生长因子和辣木油可以改善家养反刍动物的抗氧化防御能力、膜稳定性和整体冷冻存活率[8]、[9]。然而，导致冷冻损伤的分子机制，特别是与精子功能和应激反应相关的蛋白质组变化，仍不完全清楚。蛋白质组学研究表明，反刍动物精子中的许多蛋白质对精子活力、膜稳定性、 capacitation（精子获能）、顶体功能及受精能力起着重要作用[10]、[11]、[12]。此外，这些研究还揭示了冷冻保存过程中膜蛋白的变化，这些变化影响冻融存活率，尤其是在公猪精子中[13]。精子耐冻性的关键决定因素包括膜脂质组成、抗氧化防御机制以及在冷冻过程中保持膜完整性的蛋白质[14]。尽管在家养物种方面取得了这些进展，但关于埃尔德鹿精子的蛋白质组谱，尤其是在冷冻保存方面的研究仍然很少。
因此，本研究旨在表征埃尔德鹿精子在新鲜状态、冷冻前状态和解冻后的蛋白质组变化。通过比较冷冻保存各阶段的蛋白质表达模式，本研究揭示了冷冻损伤的分子基础及其对精子质量的影响。这些发现有助于更好地理解濒危物种精子保存过程中遇到的分子挑战，并可能为优化冷冻保存方案提供依据，从而支持埃尔德鹿的保护工作。
研究细节 动物 样本来自7只成年缅甸埃尔德鹿（Rucervus eldii thamin ，BED）和3只成年暹罗埃尔德鹿（Rucervus eldii siamensis ，SED），年龄在2至7岁之间。5只BED雄鹿被饲养在考考开放动物园（Khao Kheow Open Zoo），2只BED雄鹿在纳空拉差西玛动物园（Nakhon Ratchasima Zoo），3只SED雄鹿在乌汶拉差塔尼动物园（Ubon Ratchathani Zoo）。所有动物实验均遵循泰国朱拉隆功大学动物护理和使用委员会（CU–ACUC）的伦理指南进行（批准编号2431017）。精液质量评估 对来自BED（n=7）和SED（n=3）的新鲜精液、冷冻前精液及解冻后精液的精子活力、存活率、顶体完整性和膜完整性进行了评估（表1；补充表1）。与新鲜样本相比，冷冻保存显著降低了两种亚种解冻后精子的顶体和膜完整性（p<0.05）。总活力和存活率在冷冻和解冻后有所下降，但这些变化不具有统计学意义。讨论 本研究首次全面分析了埃尔德鹿精液在冷冻保存过程中的蛋白质组变化。尽管所有精液质量参数在冷冻保存过程中均有所下降，但仅BED组的顶体完整性和膜完整性显示出统计学上的显著降低。SED组的所有参数也明显下降，尤其是活力，在解冻后降至零；然而，这些变化没有统计学意义。结论 本研究全面概述了埃尔德鹿精子在三个冷冻保存阶段的蛋白质组变化，表明精子质量的逐渐下降伴随着特定阶段的蛋白质变化。冷冻前阶段表现为免疫相关蛋白和细胞骨架相关蛋白的早期变化，而解冻后阶段则表现出更明显的分子紊乱和修复相关途径的激活，尤其是泛素-蛋白酶体系统的激活。资助 本研究得到了泰国国家研究委员会（National Research Council of Thailand）、朱拉隆功大学为纪念普密蓬·阿杜拉德王陛下72周年诞辰设立的研究生奖学金（Chulalongkorn University Graduate Scholarship to Commemorate the 72nd Anniversary of His Majesty King Bhumibol Adulyadej）以及朱拉隆功大学成立90周年基金（Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund）的支持。作者贡献声明 蒙西查·尼贾兰（Monsicha Nijaran）：方法学设计、实验实施、数据管理、资金获取、初稿撰写。 西蒂鲁克·罗伊特拉库尔（Sittiruk Roytrakul）：研究概念构思、方法学设计、实验监督。 纳鲁蒙·法奥纳克罗普（Narumon Phaonakrop）：方法学设计、实验实施。 安皮卡·通帕克迪（Ampika Thongphakdee）：资源协调、方法学设计、实验监督。 伊蒂·布诺拉纳（Itti Boonorrana）：资源协调、方法学设计。 苏帕拉克·基阿特松布恩（Supalak Kiatsomboon）：方法学设计。 桑蒂塔·卡鲁恩（Santhita Karoon）：方法学设计。 古纳蓬·苏里亚帕波尔（Gunnaporn Suriyaphol）：研究概念构思、实验监督、项目管理、数据分析、资金获取。 利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢 作者感谢Nudthakamol Kajornklin女士、Pongsatorn Kongjak先生以及ZPOT团队的样本采集工作支持。特别感谢Pannawat Supapannachart博士、Wannapol Buthasane博士、Vichayanee Pumpitakkul博士和Jinjutha Aramanupanyakul博士在技术方面的专业贡献。打赏
