引言
一组被称为α-突触核蛋白病的神经退行性疾病，包括帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)、纯自主神经衰竭(PAF)和多系统萎缩(MSA)，目前尚无有效治疗方法。其共同病理基础是错误折叠的磷酸化α-突触核蛋白(P-SYN)在中枢和周围神经系统中的进行性沉积。近年来，皮肤P-SYN沉积的检测已被确立为一种敏感且特异的α-突触核蛋白病标志物，并与疾病严重程度相关。此外，在包括特发性快速眼动睡眠行为障碍(iRBD)在内的前驱期疾病患者中也观察到了皮肤P-SYN沉积。iRBD表现为睡眠中伴发声和不受控制动作的梦境演绎行为。尽管iRBD在初始就诊时通常没有α-突触核蛋白病的认知、运动或自主神经特征，但75%的iRBD患者会在诊断后10年内进展为临床明显的α-突触核蛋白病（即符合PD、DLB或MSA的临床诊断标准），超过90%会在15年内进展。然而，iRBD患者皮肤P-SYN沉积的临床和研究意义尚未完全阐明。目前，预测iRBD患者向临床明显α-突触核蛋白病发展的方法有限。开发一种在α-突触核蛋白病前驱期评估和预测表型转化概率的诊断工具是一项紧迫且未被满足的需求。
方法：临床试验方案
研究设计与队列
本研究是一项多中心、盲法、纵向、前瞻性观察性研究，旨在评估iRBD患者中的P-SYN沉积。计划招募80名iRBD和临床可能的RBD(pRBD)个体。受试者将从约10个专注于iRBD/pRBD患者的医疗中心招募。大约一半受试者(~n=40)需要通过多导睡眠图证实存在快速眼动期睡眠肌肉失弛缓(iRBD)；另一半需通过临床病史和快速眼动睡眠行为障碍筛查问卷(RBDSQ)得分≥5来确认(pRBD)。
纳入与排除标准
纳入标准包括：30-85岁的男性和女性；有反复发作的睡眠相关发声和/或复杂运动行为；存在快速眼动期睡眠肌肉失弛缓或梦境演绎行为史；部分受试者的多导睡眠图记录需符合快速眼动期睡眠肌肉失弛缓。
排除标准包括：蒙特利尔认知评估评分<19；已诊断为帕金森病、任何类型的痴呆或多系统萎缩；由其他原因（如发作性睡病、痴呆、帕金森病）引起的快速眼动睡眠行为/障碍；以及存在皮肤活检禁忌症。
研究访视与数据收集
这是一项为期2年的纵向研究，将在基线、第1年和第2年对每位患者进行3个部位的皮肤活检。每次访视时还将采集血浆。每次访视包括详细的量化神经学检查、认知评估、病史和问卷调查。研究访视内容包括：审查入组表格、知情同意、病史和当前用药审查、直立生命体征、国家阿尔茨海默病协调中心路易体痴呆模块、量化神经学检查、认知/神经测试和问卷调查、嗅觉测试、皮肤活检以及血浆采集。
数据与组织收集的标准化
为尽量减少研究结果的潜在变异性，所有组织和临床数据将使用标准方法收集。
皮肤活检样本
所有受试者将从外踝上方10厘米的远端小腿、膝关节外侧上方10厘米的远端大腿以及第7颈椎棘突外侧3厘米的后颈区域获取3毫米穿刺皮肤活检。选择这些位置是基于既往文献，这些文献显示了不同α-突触核蛋白病在近端和远端位置P-SYN沉积的差异。
皮肤活检处理与免疫染色
皮肤样本将在冷冻保护剂溶液中储存至少24小时后，用冷冻切片机切成50微米厚的切片。组织将使用我们的标准方案，用抗蛋白基因产物9.5（PGP9.5：一种泛轴突标记物）和抗磷酸化α-突触核蛋白的抗体进行免疫染色。每个活检的六个标本将用兔抗-PGP9.5和抗磷酸化α-突触核蛋白进行双重免疫染色，并如先前报道那样安装在载玻片上。
活检分析
所有活检将使用标准方案以盲法方式评估。病理学家的判读将包括每个活检部位的半定量分析，以及一个综合评分（即之前报道过的三个活检的总和）。该总和评分是一个范围从0到36个突触核蛋白单位(SU)的量表，先前已证明与疾病严重程度相关，并有助于区分疾病亚型。所有切片将完全数字化。将通过断层扫描(Z-stack)获取一系列光学图像。将进行组织的数字分析以检测和量化轴突内P-SYN。将报告每个活检标本的P-SYN定量（每平方毫米分析组织中的P-SYN平方微米数）。因此，所有3个活检的综合评分将等于所有3个活检中测量的P-SYN总和除以测量的组织面积。将记录每个组织切片中每个皮肤真皮亚结构（血管、神经束、立毛肌、汗腺和表皮下层丛）的P-SYN量。表皮内神经纤维密度(IENFD)将使用免疫染色神经纤维的标准方法计算，报告为神经纤维/毫米。
“阳性活检结果”的定义
只有P-SYN与周围神经轴突（通过抗PGP9.5和抗P-SYN免疫染色确认）共定位的活检才被视为阳性。任何不确定的切片将被视为阴性。如果三个活检部位中任何一个含有P-SYN，则该病例被视为“阳性”。
临床数据采集
所有研究数据，包括问卷、检查评分和人口统计信息，将通过电子数据采集系统输入。
盲法与数据审查
所有审查活检的研究人员将对临床数据设盲，所有临床评估者将对病理数据设盲。初步临床评估将在活检前进行，因此所有研究人员在该时间点将对皮肤活检结果设盲。
研究目标
主要目标
本研究是一项针对iRBD和pRBD个体的前瞻性纵向研究，旨在确定皮肤活检检测P-SYN在前驱疾病状态下的诊断效用。主要目标包括：1) 确定iRBD和pRBD患者中P-SYN的沉积率；2) 确定含有P-SYN的拓扑模式和特定神经纤维亚型，以预测表型转化的时间以及α-突触核蛋白病（PD、DLB或MSA）的亚型。
次要目标
为增强病理学判读，将使用一种新型机器学习算法辅助对皮肤P-SYN沉积进行数字定量分析。提取的数据将包括全玻片成像、代表性神经结构分析、靶点染色检测、分割、染色定量，并使用深度学习算法进行模式识别。结果将与病理学家判读和实际随访数据进行比较，以进一步完善模型准确性。
统计分析
基于初步数据和其他小组的发表，我们预期：1) 超过50%的iRBD和pRBD个体皮肤活检中存在P-SYN；2) 超过80%表型转化为临床明显α-突触核蛋白病的患者中存在P-SYN；3) 在整个组中，P-SYN在年度随访期间将增加超过10%；4) 感觉主导纤维中广泛沉积的P-SYN将表型转化为MSA，而自主神经主导的P-SYN沉积将是PD或DLB。我们进一步预期，DLB与PD的区别将基于以下病理特征的组合：1) P-SYN更广泛的拓扑沉积（例如，更多活检呈阳性）；2) P-SYN沉积总量更大；3) 血管运动沉积更多（例如，血管运动纤维中P-SYN百分比更高）；4) 腿部和股部活检表皮层内无髓鞘伤害性C纤维密度更低。
样本量说明
功效分析基于整个研究中达到终点目标所需的最低受试者数量。根据我们现有RBD研究中的既往自然史数据，预计在我们为期2年的研究中，受试者的脱落率约为每12个月5%。从表型转化的P-SYN阳性RBD受试者中获得足够客观病理数据（基于先前在PD、MSA和DLB患者中的工作）所需的数量为20。我们估计基线时至少50%的iRBD受试者能检测到P-SYN，其中P-SYN阳性受试者每年至少有15%的表型转化率。我们预测每年随访中，P-SYN阴性病例中转变为阳性的比例将低于10%。发生表型转化或失访的个体每年将被新招募的受试者替换，以维持相同总数的iRBD受试者。我们估计总共80名iRBD受试者将在整个研究过程中产生总共67例P-SYN阳性病例，P-SYN阳性组中有18例表型转化，P-SYN阴性组中有2例表型转化。这些数字将提供超过95%的检验效能，双侧α为0.01，以检测iRBD患者中P-SYN阳性者与阴性者之间表型转化率的差异。
讨论
快速眼动睡眠行为障碍影响了美国约0.5-1%的人口，在老年人群中的患病率显著更高。然而，确诊iRBD需要多导睡眠图，这在大规模人群研究中尤其难以实施。基于明确梦境演绎型临床症状诊断的临床可能的RBD(pRBD)，在一般人群中的患病率估计超过5%。这些研究引起了人们对未来有神经退行性疾病风险人数的担忧。目前急需可靠、可及且准确的工具来检测具有RBD临床特征患者的P-SYN。我们和其他研究者已证明，在已确诊的α-突触核蛋白病患者中，皮肤P-SYN检测具有高敏感性和特异性。这项纵向、前瞻性研究的主要目标是：1) 确定iRBD和pRBD中P-SYN的沉积率；2) 量化P-SYN沉积随时间的变化；3) 确定P-SYN沉积模式是否是iRBD向临床明显α-突触核蛋白病表型转化的预测指标。
在iRBD患者中确认P-SYN沉积是正在进行的前驱疾病研究的一个重要转折点，因为它确认了疾病的病理基础。目前强烈需要可靠的预测指标来预测向临床明显α-突触核蛋白病的表型转化。先前已证明iRBD患者皮肤中存在P-SYN是表型转化的一个预测因素，因此，缺乏P-SYN可能在一段设定时间内与较低的转化风险相关。在寻求通过靶向α-突触核蛋白疗法改变疾病自然史的研究中，确定磷酸化α-突触核蛋白的状态将是必要的。
P-SYN定量的目标尚未完全实现。迄今为止，大多数诊断工具提供报告异常蛋白存在与否的二元结果，导致疾病的生物学定义与错误折叠α-突触核蛋白的存在与否挂钩。然而，磷酸化α-突触核蛋白的真正定量测量可以为临床试验设计和RBD表型转化的预测模型提供有意义的效用。迄今为止，一些出版物已表明定量是可能的，并且在横断面研究中，这些定量测量有助于区分疾病亚型。如果在纵向随访中确认了α-突触核蛋白定量，P-SYN沉积可能提供一个潜在的生物标志物，用于评估靶点结合，并可在靶向α-突触核蛋白的疗法中加以利用。
在前驱疾病状态下量化P-SYN的能力对预后也有重要意义。RBD患者在15年内有很高的可能性进展为临床明显的α-突触核蛋白病。然而，并非所有α-突触核蛋白病都是相同的。MSA、DLB和PD患者的临床衰退速度非常不同。开发测量P-SYN沉积量和分布的算法，以预测RBD患者发展为PD、DLB或MSA，将提供重要的预后价值，并显著改变我们进行临床试验设计的方法。目前，区分α-突触核蛋白病亚型的病理特征在已确立的疾病状态中被注意到，而这项研究将确定这些特征是否能在前驱状态中被识别。
本研究设计存在一定局限性。首先，只有一半的研究受试者有多导睡眠图确认的RBD。那些有多导睡眠图的人是在历史性检查中完成的，而非研究入组时，因此无法对结果进行标准化。其次，另一半招募的患者将仅有临床确认，属于“临床可能”RBD类别。鉴于临床症状在人群中出现的频率高且无多导睡眠图确认，我们认为这是一个需要研究的重要问题。第三，表型转化率可能不会达到本试验提出的估计率。如果需要，将考虑更长的随访时间以确保足够的表型转化率。最后，用于神经纤维亚类鉴别的神经元特异性标记物是可用的，但在此规模的研究中难以实施。
结论
总之，这项针对RBD的前瞻性纵向研究将推动该领域朝着未实现的个性化精准诊断医学目标迈进。早期准确的病理确认将支持疾病的定义，而对纵向变化的定量分析将为表型转化风险和时间线提供见解。结果将有助于在疾病最早阶段改善预后。此外，P-SYN的沉积模式和随时间的变化率可能允许预测α-突触核蛋白病的亚类，例如MSA、DLB或PD。用生物标志物定义疾病特异性预后将提供重要的诊断进展，理论上可将患者的诊断历程缩短数年。最后，研究结果将支持皮肤P-SYN检测作为在疾病早期阶段开发疾病修饰临床试验框架的必要组成部分，这对于未来治疗进展至关重要。
