血管平滑肌静息活性氧稳态调控新机制：内皮素-1受体基础活性对胞质与核活性氧的负向调节作用

本研究首次揭示了在血管平滑肌细胞中，内皮素-1（ET-1）的两种受体（ETA和ETB）的基础活性共同负向调节胞质与细胞核的静息活性氧（ROS）水平，并互为生理性拮抗剂。研究证实，ET-1诱导的ROS升高不依赖于已知的ETA或ETB受体，而可能由ETA/ETB异源二聚体或ETC型受体介导，其过程依赖于胞外钙内流，为开发靶向新型ET-1受体复合物的药物提供了新见解。

1. 引言

1.1. 内皮素-1 (ET-1)

内皮素-1是一种由血管内皮细胞分泌的强效血管收缩肽，其作用比血管紧张素II强10倍，是血压的关键调节因子。ET-1通过两种G蛋白偶联受体ETA和ETB发挥生理效应。这两种受体在血管内皮细胞和平滑肌细胞中均有表达。ET_A受体激活导致缓慢、持续的血管收缩；内皮细胞上的ET_B受体激活则通过释放一氧化氮（NO）等舒张介质引起血管舒张，而平滑肌细胞上的ET_B受体激活则引起快速的血管收缩。ET-1可通过钙（Ca²⁺）依赖途径激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox）来诱导ROS信号，而ROS本身也能增加ET-1的产生，形成一个复杂的调控环路。

1.2. ET-1与钙

Ca²⁺稳态的严格调控是心血管健康与疾病的核心。在血管平滑肌细胞中，ET-1诱导的细胞内Ca²⁺持续升高由ET_A和ET_B受体共同介导，并发生在胞质和核水平。这种效应并非通过T型或L型Ca²⁺通道，而是通过一种对硝苯地平不敏感但对伊拉地平敏感的稳态电压依赖性静息型R型Ca²⁺通道激活所导致。

1.3. 钙与活性氧的交互对话

Ca²⁺和ROS信号系统紧密整合。细胞内Ca²⁺可以调节ROS的产生和清除，从而改变细胞的氧化还原状态。Ca²⁺水平升高可增强代谢，导致更多电子从呼吸链泄露，从而增加ROS的产生。

1.4. 内皮素受体二聚化？

ET-1受体可能形成同源或异源二聚体。ET-1可能作为双价配体，其N端与ET_A结合，C端与ET_B结合。目前普遍认为ET-1通过激活NADPH氧化酶增加血管平滑肌细胞中的ROS水平，但每种受体在ROS生成中的具体作用和角色，特别是在静息状态下，仍不明确。

2. 结果

2.1. ET-1受体ETA和ETB对人血管平滑肌细胞基础ROS水平的贡献

实验旨在验证内皮素受体是否参与决定人血管平滑肌细胞的静息ROS水平。

2.1.1. 阻断ETA受体对人血管平滑肌细胞静息ROS水平的影响

使用非肽类特异性ET_A拮抗剂ABT-627阻断ET_A受体的基础活性，导致全细胞、胞质和细胞核水平的静息ROS均出现统计学上的显著升高。结果总结于，表明ET_A受体具有调节静息ROS的基础活性。

2.1.2. 阻断ETB受体对人血管平滑肌细胞静息ROS水平的影响

使用非肽类特异性ET_B拮抗剂A-192621阻断ET_B受体的基础活性，同样导致全细胞、胞质和细胞核水平的静息ROS出现显著升高。数据总结于。

2.1.3. 相继阻断ETA和ETB两种受体对人血管平滑肌细胞静息ROS水平的影响

在已存在ET_A拮抗剂的情况下，再加入ET_B拮抗剂，会导致细胞核ROS水平的进一步显著升高，但全细胞和胞质ROS水平没有进一步增加。这一结果总结于，提示ET_A和ET_B受体在静息状态下互为生理性拮抗剂，阻断一个会解除其对另一个的抑制。

2.2. ET-1诱导的胞质和核ROS水平升高中ETA和ETB受体拮抗剂的作用

ET-1处理可显著增加人血管平滑肌细胞全细胞、胞质和核内的ROS水平。然而，令人惊讶的是，在ET-1存在下，阻断ET_A受体不仅没有逆转ET-1引起的ROS升高，反而进一步增加了ROS水平；而阻断ET_B受体则对ET-1引起的ROS升高没有显著影响。这强烈提示，ET-1对ROS水平的效应并非由已知的ET_A或ET_B受体介导。

2.3. 预先阻断ETA和ETB受体及谷胱甘肽对ET-1诱导的胞质和核ROS升高的影响

实验发现，预先同时阻断ET_A和ET_B受体，可以阻止ET-1诱导的胞质ROS升高，但不能阻止其诱导的核ROS升高。抗氧化剂谷胱甘肽可以完全逆转由ET-1引起的胞质ROS升高，并部分逆转核ROS的升高。这表明ET-1引起的ROS升高部分是通过消耗谷胱甘肽实现的，尤其在胞质层面。

2.4. 胞外游离钙对ET-1及其受体拮抗剂诱导的胞质和核静息ROS水平升高的影响

移除胞外培养基中的Ca²⁺会显著降低人血管平滑肌细胞的静息ROS水平。在无Ca²⁺环境中，无论是ET-1还是其受体拮抗剂，都无法再引起ROS水平的任何变化。这一结果清晰地表明，ET-1及其拮抗剂对ROS的影响完全依赖于胞外Ca²⁺的内流，可能通过激活对Ca²⁺敏感的Nox5（一种NADPH氧化酶亚型）来实现。

3. 讨论

研究结果表明，人血管平滑肌细胞中的静息ROS水平呈异质性分布，且核内水平高于胞质。ET_A和ET_B受体均具有基础活性，且该活性负向调节静息ROS水平。两种受体似乎相互拮抗，即一种受体的基础活性抑制了另一种受体的作用。阻断任一受体，都会解除这种抑制，导致ROS升高。ET-1能引起ROS的持续升高，但这种效应无法被ET_A或ET_B受体的特异性拮抗剂所阻断或预防，这提示存在第三种不敏感的受体类型。这种受体可能是研究组先前报道的ET_C型受体，但更可能是一种ET_A/ET_B异源二聚体受体。鉴于在人血管平滑肌细胞核膜上主要表达ET_B受体，核内的ET_B同源二聚体可能在调节核ROS水平中扮演重要角色。所有效应均依赖于胞外Ca²⁺内流，可能通过R型Ca²⁺通道激活Ca²⁺依赖的Nox5。

4. 材料与方法

研究使用来自供体（一名35岁女性）的人主动脉分离培养血管平滑肌细胞。通过共聚焦显微镜技术，使用羧基H2DCFDA荧光探针检测ROS，使用Cell Tracker Green CMFDA检测谷胱甘肽，并使用Syto 11进行细胞核染色。通过三维图像重建和体积渲染，分别测量全细胞、胞质和细胞核区域的荧光强度。实验过程中添加ET-1、受体拮抗剂（ABT-627, A-192621）或谷胱甘肽，观察其对ROS水平的影响，并在无钙培养基中验证钙离子的作用。数据以均值±标准误表示，采用重复测量方差分析及Bonferroni多重比较检验进行统计学分析。

5. 结论

静息ROS水平至少部分由胞质和核内的Ca²⁺水平决定，并受到如ET-1受体等的基础活性调节。一个重要发现是，ET_A-ET_B异源二聚体受体的基础活性可能介导了静息ROS水平的调控。这或许可以部分解释为何选择性ET_A或ET_B受体拮抗剂在治疗高血压方面效果有限，而ET_A-ET_B双重拮抗剂（如Aprocitentan）对治疗耐药性高血压有益。ET-1及其受体对ROS水平的调节，可能是通过激活静息稳态R型Ca²⁺通道引起Ca²⁺内流而实现的。