1. 引言
肥胖已成为全球主要的公共卫生挑战，其相关的健康问题日益受到关注。消化系统功能障碍是肥胖的常见共病，尤其以功能性消化不良（FD）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）为代表。近期的流行病学和临床研究发现，FD与NAFLD之间存在显著的共病性，在NAFLD患者中FD的患病率远高于非NAFLD人群。这种频繁的共现提示两者可能存在超越偶然的共享病理生理学基础。
事实上，FD和NAFLD的发生与发展受到多种共同因素的影响。首先，诸如肥胖、不健康的饮食模式和心理压力等关键可改变风险因素，已知会同时促成这两种疾病。其中，过量脂肪摄入或高热量饮食是诱发消化不良症状和NAFLD的共同诱因。在机制层面，研究表明高脂饮食可直接诱导小鼠胃肠道损伤，导致肠道萎缩和胃壁细胞损伤。同时，它通过增强肝脏对脂肪酸的摄取，加剧肝脏脂肪堆积，从而促进NAFLD的进展。新出现的证据进一步表明，这些外部因素可能通过破坏肠-肝轴来发挥作用。肠-肝轴的失调，包括肠道菌群改变和肠道通透性增加，目前被认为是导致FD内脏高敏感性和NAFLD肝损伤的关键共享通路。因此，FD和NAFLD不仅在临床上频繁共病，在其病因学和潜在机制上也紧密交织。这种复杂的病理关系为治疗干预带来了挑战，也创造了机会。以其整体观和强调辨证论治为特点，传统中医药在管理诸如FD-NAFLD二元病这类复杂的多系统疾病方面具有相当大的潜力。
万氏杀虫消积丸（WSXPs）是由十味药材组成的复方制剂，包括：党参、苍术、麦芽、砂仁、使君子、雷丸、山楂、厚朴、胡黄连和芦荟。该方由著名的基层中医、国家级非遗传承人邵金杰先生创制，并通过长期临床实践精炼为标准化的固定处方。WSXPs适用于由脾胃虚弱证导致的疳积和食积。值得注意的是，中医药理论中的“肝脾不和”为连接消化系统疾病（由脾/胃主导）与代谢和郁滞性病理（与肝相关）提供了一个概念框架。这种理论上的契合，使WSXPs成为研究针对FD和NAFLD的统一治疗策略的有趣科学课题。
现代药理学研究已开始验证WSXPs中关键药材的生物活性。在其成分中，山楂、党参、砂仁和麦芽被中国国家卫健委认定为药食同源物质。山楂已被证明对治疗FD和肥胖有效，并且在高脂高胆固醇饮食喂养的大鼠中显示可减少脂质堆积。党参通过IRS1/PI3K/AKT信号通路改善高脂高糖饮食诱导的T2DM小鼠的脂代谢紊乱，并对胃肠道系统发挥保护作用，包括缓解炎症性肠病、减轻胃溃疡以及保肝活性。砂仁广泛用于治疗胃肠道疾病，并在功能性消化不良、胃炎和儿童幽门螺杆菌感染中显示出临床疗效。此外，麦芽的美拉德反应产物被认为是治疗FD的主要活性成分。
WSXPs的其他成分也表现出相关的药理学特性。例如，厚朴据报道可调节胃肠激素、调节物质代谢并保护肠道屏障。其主要生物活性化合物和厚朴酚已被证明可缓解蛋氨酸-胆碱缺乏饮食小鼠模型中的脂质和胆汁酸代谢紊乱，同时上调肠道益生菌的丰度。重要的是，厚朴皮临床提取物已证明可降低NAFLD患者的肝脏脂肪含量。这些发现为WSXP复方的多靶点潜力提供了科学基础。
因此，本研究旨在探究WSXPs抗FD的治疗机制及其对NAFLD病理的潜在影响。我们采用了一种整合策略，综合利用动物模型、细胞实验和网络药理学。在FD小鼠模型中系统地评估了WSXPs的疗效。在肝脂肪变性细胞模型中检查了其对脂质代谢和炎症的直接影响。此外，应用网络药理学分析来预测所涉及的生物活性化合物和关键通路。这项工作为支持WSXPs作为整合治疗剂的临床转化和开发提供了实验证据。
2. 结果
2.1. 万氏杀虫消积丸（WSXPs）的安全性评估
根据《药物重复给药毒性试验技术指导原则》对WSXPs进行了初步安全性评估。昆明（KM）小鼠每天通过灌胃给予低剂量（WSXP-L）或中剂量（WSXP-M）的制剂，持续一个月。通过血清生化分析和主要器官的组织病理学检查来评估潜在的系统毒性。
用WSXP-L和WSXP-M治疗未引起肝功能标志物（ALT、AST、TBIL、DBIL）、肾功能（BUN、CREA）或脂质代谢（TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C）的显著改变。值得注意的是，与对照组相比，中剂量WSXP（WSXP-M）的给药特异性地显著降低了血清LDL-C水平，提示该制剂在调节脂质代谢方面的潜在作用。
H&E（苏木精-伊红）染色显示，在所有治疗组中，肝脏、肾脏或小肠均未见明显的病理变化。值得注意的是，虽然WSXP-L组在任何检查的器官中均未显示出显著的形态学改变，但WSXP-M组与正常对照组相比，显示脾脏结节数量减少以及红髓和白髓交界处结构紊乱。这一发现表明，中剂量给药可能对脾脏形态产生影响。此外，其他主要器官相对于脑或体重的重量比在任何WSXP治疗组和对照组之间均无显著差异。这些结果表明，WSXP-L在所有检查参数上均显示出良好的安全性特征。对于WSXP-M，虽然大多数安全性指标保持正常，但观察到的脾脏形态变化表明，中剂量给药可能对脾脏形态产生影响，这值得进一步研究。
2.2. WSXP改善FD小鼠模型的胃肠功能障碍
通过不规律喂养结合L-精氨酸（L-Arg）给药，在昆明小鼠中成功建立了功能性消化不良（FD）模型。经过一周的建模后药物干预，与正常对照组相比，模型组观察到显著的胃肠动力障碍。具体而言，模型组显示胃炭末排空率降低了43.8%，小肠推进率降低了15%，证实了FD模型复制成功。
WSXP治疗有效逆转了这些功能障碍。与模型组相比，低、中、高剂量WSXP组以及多潘立酮（阳性对照）组均显著增加了小肠推进率。此外，高剂量WSXP组和多潘立酮组显著降低了胃炭末残留率。这些结果表明WSXPs对胃肠动力有剂量依赖性的改善作用，其中高剂量方案显示出最显著的效果，与多潘立酮相当。
为阐明潜在机制，通过ELISA（酶联免疫吸附试验）分析了血清中关键胃肠调节肽的水平。模型组显示胃动素（MTL）和胃泌素（GAS）水平显著降低，同时血管活性肠肽（VIP）和胆囊收缩素（CCK）水平显著升高。WSXP治疗逆转了这些异常的激素变化。与模型组相比，所有WSXP治疗组均显著提高了降低的MTL和GAS水平，并显著降低了升高的VIP和CCK水平。
2.3. WSXPs对FD小鼠肠道菌群的影响
通过分析β多样性和α多样性评估了WSXPs对FD小鼠肠道菌群的影响。主坐标分析（PCoA）和非度量多维标度法（NMDS）显示，FD模型组和正常对照组样本之间存在明显分离，表明FD诱导显著改变了肠道菌群的整体结构。在α多样性方面，与对照组相比，FD模型组的物种丰富度指数和综合多样性指数显著增加。
在门水平上对微生物组成的分析显示，在FD模型组中，几种与肠道健康相关的门的相对丰度降低。具体来说，与肠道屏障功能相关的疣微菌门和放线菌门的丰度低于对照组。
为研究不同干预措施对FD的调节作用，进行了线性判别分析效应量（LEfSe）分析。结果表明，中剂量和高剂量WSXP干预均特异性地富集了益生菌Akkermansia muciniphila。这种富集在其整个分类谱系中都观察到，从门水平到属水平均显示显著增加。这些发现表明，WSXPs可能通过特异性促进这种已知具有粘膜修复功能的关键有益细菌来改善FD。
2.4. WSXP在HepG2非酒精性脂肪肝（NAFLD）细胞模型中减轻脂质积累和炎症
基于慢性毒性研究中观察到的对血清LDL-C的显著抑制作用，我们在细胞水平进一步研究了WSXPs的潜在降脂和抗炎功效。在HepG2细胞中，通过油酸钠和棕榈酸钠共诱导建立了NAFLD模型，以评估WSXPs对细胞内脂质积累和相关炎症反应的影响。
结果表明，与对照组相比，共诱导显著提高了模型组细胞培养上清液中甘油三酯（TG）和炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。用浓度范围为1 mg/mL至0.25 mg/mL的WSXPs进行干预，以剂量依赖性的方式有效抑制了TG的积累和这些炎性因子的释放。
油红O染色结果与生化发现一致。显微镜观察显示，模型组细胞中存在大量被染成红色的脂滴，而在所有WSXP处理组中，脂滴均显著减少。值得注意的是，用1 mg/mL WSXP处理显著减少了细胞内的油红O阳性面积，且此效果优于阿托伐他汀（立普妥）阳性对照组。
这些发现证实，在该细胞模型中，WSXP具有显著的减少脂质积累和抑制炎症的双重功效，为动物实验中观察到的降脂作用提供了直接的体外证据。
2.5. 网络药理学分析识别WSXPs的潜在物质基础和作用机制
采用网络药理学预测WSXPs对抗FD和NAFLD的活性成分和机制。筛选从WSXPs中鉴定出83种生物活性化合物，对应588个预测靶点。这些靶点与360个FD相关基因和1476个NAFLD相关基因相交，产生了60个核心潜在治疗靶点。对这60个靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示具有很强的连接性。GO（基因本体论）分析揭示了在与胃肠功能密切相关的生物过程中的富集，包括平滑肌细胞增殖的调节和对氧水平的反应。
KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析显示，核心靶点主要参与PI3K-Akt信号通路，这是细胞代谢、生长和运动的核心调节通路。随后构建了一个综合的“化合物-靶点-通路”网络，揭示了从多种草药成分中衍生的28种关键生物活性化合物——包括雷丸、党参、苍术、厚朴、砂仁、山楂叶、麦芽和胡黄连——都参与了这一核心通路的调节。这些结果提示了可能贡献于该方剂治疗作用的具体靶点和化合物，为未来的实验验证提供了基础。
3. 讨论
这项综合性研究评估了万氏杀虫消积丸（WSXPs）治疗功能性消化不良（FD）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的潜力及安全性。对于FD部分，采用不规律饮食联合腹腔注射L-精氨酸（L-Arg）的方法建立了动物模型。这种建模方法与FD的临床病因密切相关，因为不规律的饮食习惯是FD发生的关键因素。L-Arg诱导FD的机制主要通过一氧化氮（NO）通路介导：L-Arg是NO合成的底物，而NO是胃动力和分泌的有效调节剂，通过激活迷走神经中的胆碱能神经元来抑制胃动力。对于NAFLD部分，采用基于HepG2的脂肪变性细胞模型来研究WSXPs的降脂作用。这种体外模型被广泛认为是研究NAFLD及相关代谢疾病的标准化和可重复系统。
实验表明，WSXP（3~12 g/kg）缓解了FD模型小鼠的核心症状。它显著增加了胃排空率和小肠推进率。同时，WSXPs上调了血清中胃动素（MTL）和胃泌素（GAS）的水平，以增强胃肠道收缩和动力。相反，它下调了血管活性肠肽（VIP）和胆囊收缩素（CCK）的水平，从而减轻它们对肠道运动的生理抑制作用。这种双向调节作用证明了其多靶点作用。此外，在一项慢性毒性研究中，WSXP-M特异性地降低了血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。在体外实验中，证实了WSXP在细胞模型中抑制了脂质的生成。
我们对WSXPs对FD影响的研究发现，它显著增加了模型小鼠肠道中有益细菌疣微菌门的相对丰度。该门的代表物种Akkermansia muciniphila与改善肠道屏障功能密切相关。在机制上，A. muciniphila通过降解胃肠道粘蛋白产生短链脂肪酸（SCFAs），如乙酸、丙酸和丁酸。这些SCFAs作为信号分子调节宿主脂质代谢，并且对能量平衡和葡萄糖稳态至关重要。它们还调节神经递质水平，增加肠道5-HT合成并降低SERT表达，从而改善肠-脑轴通讯。此外，补充A. muciniphila可促进肠道干细胞增殖，增加杯状细胞数量，并增强上皮再生。这些发现表明，WSXPs可能部分通过调节疣微菌门的丰度并利用A. muciniphila多方面的有益作用来改善FD病理。
在体外观察到的WSXPs对肝脏的益处，结合网络药理学的预测，指向PI3K-Akt信号通路作为一个汇聚机制。该通路核心调控细胞生长、代谢和炎症。在肝脏中，PI3K-Akt激活可通过SREBP-1c促进脂肪生成，而其调节也涉及Saroglitazar等NAFLD治疗药物的作用。调节PI3K/Akt/NF-κB通路已被证明可缓解幽门螺杆菌诱导的胃炎。幽门螺杆菌感染也是FD的一个公认促成因素。尽管这些发现是预测性的，需要实验验证，但它们确定了PI3K-Akt通路作为未来探索WSXPs在改善肝脂肪变性和胃肠功能障碍方面的一个候选机制靶点。
尽管这项综合性研究为WSXPs的治疗潜力提供了令人信服的证据，但应承认几个固有的局限性，以便将研究结果置于背景中并指导未来的工作。首先，用于NAFLD研究的HepG2细胞系来源于人类肝癌，尽管它是研究肝脂肪变性广泛认可和标准化的体外模型，但不能完全再现原代人肝细胞的代谢特征。这限制了观察到的降脂效应的转化潜力。其次，虽然高脂摄入是FD和NAFLD共同的病因学因素，但本研究的实验条件并未在体内FD模型和体外脂肪变性模型中保持一致的高脂诱导模式。FD模型采用不规律饮食结合L-精氨酸注射建立，而肝脂肪变性模型则通过油酸在HepG2细胞中诱导。因此，尽管在两个模型中都观察到了显著的治疗效果，但WSXPs对FD-NAFLD共病疗效的一致性应谨慎解读。目前的研究结果表明，WSXP在体内缓解FD症状，并在体外减少脂肪酸诱导的肝细胞脂质积累，突出了其潜在的双重治疗价值。然而，这些效应是否可直接转移到共病状态仍有待验证。第三，关键信号通路，如PI3K-Akt，主要是通过网络药理学预测确定的。后续研究必须通过实验验证这些计算预测，并阐明其精确的机制基础。未来的研究应优先开发和验证在一致的饮食条件下重现FD和NAFLD特征的共病动物模型，以直接评估WSXPs的整体疗效。
4. 材料与方法
4.1. 试剂与药物
万氏杀虫消积丸（WSXPs）由罗田万密斋医院提供。该药丸由以下生药组成：党参、苍术、山楂、麦芽、砂仁、使君子、雷丸、厚朴、胡黄连和芦荟。生药按指定配比混合，水煎三次。三次煎液合并，加热浓缩，干燥得到浸膏。从一副药（55g生药）中，约生产20g浓缩丸，相当于每克药丸含2.75g生药。
4.2. 动物分组与处理
总共90只雄性KM小鼠用于实验。所有动物在无特定病原体条件下饲养。适应5天后，按体重分层并顺序编号。使用随机数字表，将每个体重层内的小鼠随机分配到实验组。对于药效研究，60只小鼠随机分为六组。FD模型通过不规律喂养方案建立，包括交替进行2天正常喂养和1天禁食，总持续10天。在此建模期后，小鼠接受指定的药物治疗7天。FD小鼠模型通过腹腔注射L-精氨酸建立，这是一种诱导以胃排空延迟为特征的胃肠动力障碍的成熟方法。
对于毒理学评估，剩余的30只小鼠随机分为三组。
4.3. 检测小鼠胃排空率和小肠推进率
通过测量胃排空和肠道推进率来评估胃肠动力。简而言之，糊剂由羧甲基纤维素、奶粉、蔗糖、可溶性淀粉和活性炭与蒸馏水混合制成均匀的半固体混合物。每只小鼠灌胃0.5 mL糊剂。30分钟后，将小鼠麻醉并处死。然后切除整个胃并称重。随后，沿胃大弯切开胃，用PBS缓冲液冲洗其内容物。将排空的胃在滤纸上吸干后再次称重。小心分离小肠，平铺在测量板上，拍照分析。按公式计算胃排空率和小肠推进率。
4.4. 小鼠盲肠内容物16S rRNA分析
处死后，收集每只小鼠的盲肠内容物。为了获得用于测序的代表性样本，将同一组内所有10只小鼠的等量DNA混合，构建每个组一个文库。混合文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行三重测序。所有原始测序数据均使用在线平台CloudPlatform进行处理和分析。
4.5. 血清MTL、GAS、VIP、CCK水平
使用商业酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测量血清中胃肠激素的水平，包括胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、血管活性肠肽（VIP）和胆囊收缩素（CCK）。所有程序均严格按照制造商的方案进行。
4.6. WSXP安全性评估
根据《药物重复给药毒性试验技术指导原则》，对照组和中、高剂量WSXPs组治疗一个月。随后收集血清以评估肝功能、肾功能和血脂谱。所有生化分析均使用全自动生化分析仪进行。器官组织立即在4%多聚甲醛中固定72小时，用于后续病理切片和染色。
4.7. 细胞培养与处理
4.7.1. 细胞培养
HepG2细胞购自富恒生物。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM中培养。细胞在37°C、含5% CO2的湿润环境中维持，并在达到80-90%汇合度时传代。
4.7.2. 非酒精性脂肪肝细胞模型的建立
为了诱导细胞内脂质积累，将HepG2细胞暴露于含有500 µM油酸钠和250 µM棕榈酸钠的最终诱导培养基中48小时，以建立体外非酒精性脂肪肝病（NAFLD）模型。
4.7.3. 实验分组与药物处理
模型诱导后，将细胞分配到以下组别：对照组、模型组、WSXP处理组、阳性对照组。所有处理持续24小时。
4.7.4. ELISA法测量生化标志物
处理24小时后，收集细胞培养上清液。使用商业ELISA试剂盒按照说明书量化上清液中甘油三酯（TG）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度。
4.7.5. 油红O染色
为了直观评估细胞内脂质积累，将细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种在6孔板中，并进行上述处理。处理后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，然后按照提供的方案使用油红O染色试剂盒进行染色。对于脂质积累的定量分析，使用ImageJ软件测量油红
