1. 引言
1.1. 甜樱桃与酸樱桃的起源和生产
甜樱桃（Prunus avium L.）和酸樱桃（Prunus cerasus L.）是具有重要经济价值的核果，主要用于果实生产。甜樱桃和酸樱桃的起源地通常被认为是东欧和西亚之间的地区。特别是，甜樱桃起源于里海和黑海周围地区，而酸樱桃被认为原产于里海和西北欧及中欧之间的地区。这两种水果在欧洲和西亚长期育种，已成为当地文化的传统主食。2020年，全球甜樱桃产量约为260万吨，而酸樱桃产量约为140万吨。消费者对甜樱桃的偏好表明，在欧洲，首要考虑的是坚实的红色或深红色果皮颜色，并且普遍偏爱更大的果实。因此，近年来育种重点一直放在果实大小、硬度和果皮颜色上，以商业化推广优质新品种。
1.2. 甜樱桃和酸樱桃的遗传学与果实大小基因分型
甜樱桃是二倍体（2n = 2x = 16），基因组相对较小（338 Mb）。酸樱桃最近被确定为甜樱桃和蒙古樱桃（Prunus fruticosa Pall.）的天然杂交种，是一种异源四倍体（2n = 4x = 32）物种，基因组大小为599 Mb。近年来，甜樱桃和酸樱桃的基因组都已被测序，为基因表达和功能提供了更清晰的图景。基于已知基因组的分子标记开发为鉴定有价值的性状相关标记提供了机会。在甜樱桃中，大多数研究发现甜樱桃基因组连锁群2上的一个热点区域与果实大小表型最为相关。在一项涉及四个后代和23个栽培品种的研究中，最重要的数量性状位点（QTL）是LG2上的FW_G2a，侧翼为CPSCT038和BPPCT034标记。这个染色体区域似乎还包含其他重要性状的基因，如开花时间和果实硬度。本研究的首要目标是利用与果实大小性状相关的分子标记，分析和鉴定用于预育种和育种选择的可能候选材料，并在种质资源库中选择具有高育种潜力的亲本系，从而实现对杂交群体中不同果实大小的早期筛选。
2. 结果
2.1. 甜樱桃表型分析
在2016年至2021年间分析的40个甜樱桃种质资源在果实大小和重量上表现出差异。记录到的最小果实是‘Késői vadcseresznye’，其果实直径、长度和厚度在各年份中都是最小的。相反，‘Plakucsnaja’的果实最大，直径28.82毫米，长度25.51毫米，厚度24.35毫米。果实大小在不同种质资源间差异很大，最小果实为2.55克（‘Késői vadcseresznye’），最大果实为12.18克（‘Plakucsnaja’）。
2.2. 酸樱桃表型分析
在本研究中分析了31个酸樱桃种质资源。在2021年至2023年间进行了连续三年的果实大小和重量表型分析。‘Helyi sötét’的果实直径、长度和厚度最小，而‘Mogyoródi kései’的果实直径、长度和厚度最大。所评估种质资源中，观测到的果实重量在2.31克（‘Helyi sötét’）到6.93克（‘Mogyoródi kései’）之间变化。
2.3. 甜樱桃遗传分析及其与表型数据的关联
所测试的分子标记在甜樱桃中显示出多态性，其中BPPCT034观察到9个等位基因，长度在222到257个碱基对（bp）之间，CPSCT038观察到4个等位基因，跨度从190到204个碱基对。主要的观察到的基因型包括CPST038192 /192 和BPPCT034223 /223 ，以及CPST038190 /190 和BPPCT034255 /255 等。单因素方差分析（ANOVA）根据果实重量将基因型分为10个显著不同的组。携带CPST038190 和BPPCT034255 等位基因纯合形式的组包含最多的种质资源，平均果实重量为8.89克。果实最小的种质资源携带CPST038192 和BPPCT034223 等位基因，且均为纯合形式。
皮尔逊相关矩阵显示等位基因与表型之间存在相关性：果实大小（长度、直径、厚度）、重量与CPSCT038190 和BPPCT034255 等位基因呈正相关。此外，BPPCT034223 与果实大小和重量呈负相关。对于BPPCT034255 ，纯合形式对应较高的果实重量，而BPPCT034223 等位基因纯合形式则导致较小的果实。对于CPSCT038标记，如果CPSCT038190 等位基因不存在，则表明果实较小，而CPSCT038192 等位基因的纯合形式也会导致果实重量下降。
2.4. 酸樱桃遗传分析及其与表型数据的关联
对31个种质资源测试了两个SSR标记，观察到了与甜樱桃相似的多态性。BPPCT034的等位基因大小在204到251个碱基对之间，而CPSCT038的等位基因大小在185到204个碱基对之间。由于高度多态性和四倍体酸樱桃更高的倍性水平，观察到了多种基因型。总共检测到21种独特的等位基因组合。
将基因型数据与表型进行比较时，BPPCT034和CPSCT038等位基因显示出与果实大小和重量特征的相关性。CPSCT038190 与直径、长度、厚度和重量呈负相关，而CPSCT038185 和CPSCT038204 均与果实大小呈显著正相关。BPPCT034208 与果实直径、长度、厚度和重量呈负相关，而BPPCT034204 则呈正相关。某些等位基因对果实重量的剂量效应也被观察到。携带一个或两个拷贝的BPPCT034237 等位基因有助于提高果实重量，而BPPCT034208 等位基因的纯合形式则存在于果实较小的酸樱桃中。与不携带该等位基因的植株相比，携带两个或四个拷贝CPSCT190 等位基因的种质资源果实较小。如果检测到CPSCT192 等位基因为纯合形式，则与较高的果实重量相关。
2.5. 甜樱桃和酸樱桃的主成分分析
对甜樱桃和酸樱桃进行了主成分分析（PCA），使用两个SSR标记BPPCT034和CPSCT038以及重量，可以观察到基于分子标记大小和组合的不同组别。在甜樱桃中，基于分析的SSR标记的等位基因，确定了四个不同的组，果实重量在小果、中小果、中果和大果之间变化。
在酸樱桃中，观察到了两个不同的组，分别被小果和大果分开。样本分为两组，在重量5克处有清晰的分离。一组主要由大果种质资源组成，携带两个到四个拷贝的CPSCT038185 和CPSCT038204 等位基因，而代表小果种质资源的组则携带两个到四个拷贝的CPSCT08190 等位基因。对于BBPCT034标记，在两个拷贝中携带204个碱基对等位基因的情况在大果酸樱桃组中更常见，而在小果种质资源组中，在两个拷贝中携带208个碱基对等位基因的情况更常见。
3. 讨论
3.1. 甜樱桃果实大小和重量分析
根据研究结果，可以利用CPSCT038和BPPCT034 SSR标记对匈牙利甜樱桃群体和种质库种质资源进行果实大小和重量的区分。与之前的研究结果一致，单倍型190-255被观察到与大果相关。单倍型192-223和204-235与小果相关。然而，等位基因组合190-257并未像先前研究建议的那样明确与小果尺寸相关。在分析中，最大和最重的果实来自‘Vaszilisza’，观察到的重量超过10克，其携带单倍型190-257。这可能是由于研究的种质资源库与之前分析的栽培品种具有不同的遗传背景。CPSCT038190 和BPPCT034255 均显示出与果实大小和重量性状的中等到强烈的正相关，表明这些等位基因在未来育种选择中的重要性。PCA显示了基于亲缘关系的不同组，并且这些组可以在基于遗传距离的进化树上识别出来。携带190-255单倍型且在该位点为纯合的大果种质资源集群包含两个乌克兰起源的种质资源，以及几个可能的‘Badacsonyi’和‘Kecskecsöcsű’变体。这表明这些种质资源之间可能存在亲缘关系。
3.2. 酸樱桃果实大小和重量分析
在酸樱桃中，测试了BPPCT034和CPSCT034 SSR标记，以确定它们是否对匈牙利本地种质资源的果实大小和重量有贡献。由于高度的多态性，所分析的酸樱桃群体中，大多数等位基因组合被观察到是独特的。仅少数情况下观察到等位基因组合的共性，有小果、中果和大果大小的等位基因组合在超过一个种质资源中被发现。然而，由于高度多态性，似乎没有观察到与果实大小相关的明确等位基因组合。进一步的相关性分析表明，果实大小特征与BPPCT034204 等位基因呈中等到强的正相关，与BPPCT034237 等位基因呈弱正相关，而BPPCT034208 与小果尺寸呈强相关。CPSCT038185 和CPSCT038204 均与大果呈中等相关，而果实大小特征与CPSCT038190 之间观察到弱到中等的负相关。这与甜樱桃的结果形成对比，这可能是因为果实物种和倍性水平的差异。在酸樱桃中，PCA图显示两个不同的组，在进化树上也可以观察到相同的模式。所有‘Pándy’型酸樱桃都位于大果种质资源组中，而最重要的匈牙利商业栽培品种‘Érdi bőtermő’则聚集在另一组。
4. 材料与方法
4.1. 甜樱桃和酸樱桃的样本收集和表型分析
在种质资源库中，根据可用性和克隆的存在情况，每个种质资源考虑了2到4个克隆。根据多年的表型分析和种质资源之间的差异选择植物材料。在2016年至2021年间，从单个树上收集了40个甜樱桃种质资源以及参考品种‘Van’和‘Regina’的果实，为期3至5年。对于酸樱桃，选择了31个种质资源和参考品种，并在2021年至2023年间进行了表型分析。参考品种被纳入以获得可比和可重复的数据，并将这些品种与本地种质资源进行比较。样本收集在成熟期进行，每年从5月中旬到6月中旬（甜樱桃）和6月中旬到7月初（酸樱桃）不等。为确保均匀分布，从每个种质资源的东、西、南、北方向随机采集约500克果实。基于外观，丢弃受损果实，为每个分析的种质资源选择20个果实进行表型分析。使用标准卡尺测量果实的直径、长度和厚度，并使用精密科学天平测量果实重量。对每个种质资源，测量二十个健康的果实，并且每年的分析都重复测量。
4.2. 基因分型：DNA提取、PCR和片段分析
从甜樱桃和酸樱桃的每个种质资源的单个树上收集四片叶子。按照制造商的说明，使用植物基因组DNA小量提取试剂盒提取DNA。使用微量分光光度计对平均浓度为50纳克/微升的DNA进行定量。使用DreamTaq聚合酶、2.5毫摩尔/升氯化镁、每种脱氧核苷三磷酸0.2毫摩尔/升、每种引物0.25微摩尔/升和1纳克基因组DNA，在总体积为20微升的反应体系中进行聚合酶链反应。为减少蛋白质污染，反应混合物中还添加了牛血清白蛋白（BSA）和二甲基亚砜（DMSO）。PCR条件根据制造商的方案进行优化。为了评估SSR片段的准确大小，在每个正向引物的5'端添加了荧光染料6-FAM，并使用自动化测序仪通过毛细管电泳分析样品。使用Thermo Fisher Peak ScannerTM 软件进行等位基因大小测定和评估。
4.3. 统计分析
进行统计分析以根据评估的性状区分研究的种质资源和基因型。果实重量与直径、长度和厚度高度相关，表明大小相关性状之间存在高度多重共线性。因此，为避免多重共线性并简化解释，后续表型分析集中在果实重量上，并进行单因素方差分析，然后进行Games-Howell事后检验以区分基因型。选择Games-Howell检验来比较组均值，因为Levene检验对于因变量果实重量显著，表明违反了方差同质性假设。尽管Shapiro-Wilk检验显著，但通过直方图以及偏度和峰度值的视觉检查评估了数据的正态性，数据被认为是近似正态分布的。对于基因型-表型相关分析，应用皮尔逊相关来检测单个等位基因与观察到的表型之间的相关性。对于每个性状，使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。虽然它很显著，但偏度和峰度值的绝对值低于1，表明与正态性仅有轻微偏差。直方图和Q-Q图的视觉检查也证实了这一点。因此，数据被视为近似正态分布，并应用了皮尔逊相关。使用IBM SPSS Statistics for Windows version 26软件进行单因素方差分析和皮尔逊相关分析。在RStudio中进行主成分分析，以区分种质资源和分子标记，从而根据每个等位基因的存在和分布对每个种质资源进行分类。对甜樱桃和酸樱桃的CPSCT038和BPPCT034进行了倍性分析，在RStudio脚本中，将数据转换为向量以进行等位基因分析。转换后，基于先前发布的公式分析了等位基因频率、期望杂合度、多态信息含量、有效多重比率、标记指数、观测杂合度、分辨力和辨别力。
5. 结论
自从首次分析FW_G2a位点和PavCNR12基因以来，已经进行了多项关于该位点重要性及其与果实大小和重量特征相关性的研究，以及侧翼该基因的两个分子标记BPPCT034和CPSCT038。在本研究中，我们展示了一个更大的甜樱桃种质资源集合，并整合了酸樱桃，证明了SSR标记BPPCT034和CPSCT038可用于筛选匈牙利本地甜樱桃和酸樱桃种质资源。果实大小和重量对育种者来说是宝贵的性状，使用分子标记作为筛选群体以进行选择的整合工具正变得越来越普遍，以便能够更有效地培育新品种。通过标记辅助选择，可以对杂交种进行早期选择。可以预选携带与大果尺寸相关等位基因的杂交种，并且可以在幼苗阶段对潜在的小果杂交种进行负向选择。因此，需要培育和评估多年的杂交种数量减少，从而降低了育种成本和劳动力。此外，基于基因型而非仅仅依赖表型观察来精心选择亲本系，可以提高找到具有所需性状的杂交种的成功率。通过筛选亲本栽培品种并选择那些携带与大果尺寸相关等位基因且为纯合形式的个体，可以增加F1群体中出现大果尺寸的可能性。种质资源库中可用的材料为我们提供了有利的遗传变异性，使我们能够识别可能整合到我们育种计划中的候选材料。在本研究中，我们重点研究了匈牙利本地种质资源材料，以根据其果实大小和重量特征识别有价值的种质资源。在甜樱桃中，最大的果实是在源自乌克兰的种质资源‘Vaszilisza’中观察到的，而在酸樱桃中，最大的果实记录是‘Mogyoródi kései’。大果在本地和国际市场上非常受欢迎，特别是当同时具备其他特性，如果实硬度、抗裂性和优异的风味特征时。‘Vaszilisza’和‘Mogyoródi kései’种质资源未来可用于其有利特性，并整合到我们的育种计划中，以开发新的、独特的匈牙利甜樱桃和酸樱桃品种。多个甜樱桃种质资源携带纯合形式的单倍型190-255。这些种质资源可以作为亲本系在育种计划中有用，在这种情况下，后代将继承这种正向性状。分子标记BPPCT034和CPSCT038都可作为果实大小和重量的指标，能够根据果实大小识别不同的种质资源。此外，与重量观测结果一致，也观察到与果实大小特征的显著相关性。据我们所知，这是第一项在匈牙利本地酸樱桃群体中包含CPSCT038和BPPCT034标记果实大小分析的研究。
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