1. 引言
随着全球人口增长，猪肉需求持续增加，从“同一健康”的角度出发，生猪感染性疾病的防治变得前所未有的重要。为了尽可能减少抗生素的使用，寻找能够帮助缓解氧化应激和炎症的替代物质成为研究重点，这两者正是感染性疾病的核心病理环节。猪是兽医转化研究中的重要物种，与人类在解剖、遗传和免疫学方面具有诸多相似性。因此，利用猪外周血单核细胞作为研究模型，具有重要的科学价值。
本研究旨在探究槲皮素在猪外周血单核细胞中的抗氧化和免疫调节作用。槲皮素是一种多酚类黄酮，广泛存在于水果、蔬菜和植物性饮料中，其抗氧化和抗炎特性已得到广泛报道。然而，其在猪免疫细胞中的作用研究仍然有限。我们分别使用不同来源的细菌脂多糖（包括鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌来源的LPS）以及植物凝集素刀豆蛋白A和植物血凝素刺激pPBMCs，构建体外炎症模型，并评估槲皮素对细胞内活性氧水平以及促炎细胞因子白细胞介素-6和白细胞介素-8分泌的影响。
2. 材料与方法
实验使用了来自三头猪的外周血样本分离pPBMCs，细胞分离后在不同培养板中接种。通过细胞计数试剂盒-8法检测了不同浓度的槲皮素、LPS、ConA和PHA对细胞代谢活性的影响。结果显示，所有处理均未导致细胞代谢活性显著降低，而浓度为2.5 μg/mL的ConA甚至增加了细胞代谢活性。
为评估氧化应激水平，研究采用DCFH-DA法测定细胞内活性氧水平。同时，通过猪特异性酶联免疫吸附试验试剂盒测定了细胞培养上清液中IL-6和IL-8的浓度。实验设置了单一刺激物处理组以及刺激物与两种浓度槲皮素的联合处理组。针对LPS的处理和检测在24小时后进行，而针对ConA和PHA的处理则在48小时后进行，这反映了不同刺激剂作用动力学的差异。
3. 结果
3.1. 槲皮素的抗氧化效果
在氧化应激方面，研究结果清晰地展示了槲皮素的抗氧化潜力。经鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来源的LPS刺激24小时后，pPBMCs的细胞内ROS水平显著升高。然而，与LPS单独处理相比，所有LPS与槲皮素的联合处理都显著降低了细胞内ROS的产生。
类似地，用ConA或PHA刺激48小时也显著增加了细胞内ROS。有趣的是，当槲皮素单独作用48小时，在50 μM浓度下反而显著增加了ROS水平，呈现出“槲皮素悖论”现象，即高浓度或长时间暴露可能表现出促氧化作用。然而，当槲皮素与ConA或PHA同时处理细胞时，它成功逆转了这两种刺激物引起的ROS升高，显著降低了氧化应激水平。
3.2. 对促炎细胞因子IL-6的影响
在细胞因子调节方面，结果则更为复杂。在IL-6的产生上，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌来源的LPS，以及所有测试浓度的ConA和PHA，均能显著诱导IL-6水平升高。然而，无论是单独使用还是与LPS、ConA或PHA联合使用，槲皮素均未引起IL-6水平的显著变化。
3.3. 对促炎细胞因子IL-8的影响
对于另一种关键趋化因子IL-8，其反应模式与IL-6不同。所有三种LPS单独处理均能显著提高IL-8水平。值得注意的是，50 μM的槲皮素单独处理也显著增加了IL-8的产生。更令人意外的是，当槲皮素与鼠伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌的LPS联合使用时，进一步加剧了IL-8的升高，表现出促炎效应。
相比之下，ConA和低浓度PHA对IL-8的产生没有显著影响，而高浓度PHA甚至降低了IL-8水平。只有在高浓度PHA与25 μM槲皮素联合处理时，才观察到IL-8水平的增加。
4. 讨论
本研究利用pPBMCs模型评估了槲皮素在炎症条件下的作用。结果表明，槲皮素在实验条件下表现出明确的抗氧化特性，能有效缓解由LPS、ConA和PHA诱导的氧化应激。这一发现与许多先前在人类、犬类及猪肠道细胞中的研究结果一致，支持了槲皮素作为潜在抗氧化剂的价值。
然而，槲皮素的抗炎作用在本模型中的表现并不一致。尽管文献广泛报道了槲皮素抑制促炎细胞因子的能力，但在本研究中，它未能降低IL-6水平，甚至在特定条件下（50 μM浓度，单独或与LPS联用）增加了IL-8的产生。这种差异可能归因于多种因素，包括细胞类型特异性、槲皮素浓度、暴露时间以及复杂的细胞因子调控网络。IL-6的表达受多种转录因子调控，而IL-8主要由单核/巨噬细胞等固有免疫细胞产生，对T细胞丝裂原的反应较弱。本研究中观察到的槲皮素对IL-8的促进作用，可能与高浓度或长时间暴露下槲皮素发生的“促氧化”转变有关，这可能通过氧化还原敏感的信号通路（如核因子κB通路）影响细胞因子产生。
不同来源LPS引发的差异性反应也值得关注。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌LPS能有效诱导ROS和细胞因子产生，而肠炎沙门氏菌LPS在诱导ROS方面效果较弱。这可能反映了不同细菌血清型在猪体内的流行程度、致病性及其LPS结构的差异。
5. 结论
综上所述，我们的研究证实，猪外周血单核细胞能对不同刺激物产生可靠的氧化应激和炎症反应，验证了其作为研究大动物免疫反应的相关模型的实用性。槲皮素在该模型中展现出明确的抗氧化活性，但其免疫调节作用具有背景依赖性，并非单纯的抑制作用。在实验条件下，槲皮素并未显示出明确的抗炎效果，甚至在特定场景下表现出促炎潜力。这些结果突显了槲皮素作用的复杂性。
本研究的发现为理解黄酮类化合物在猪免疫细胞中的作用提供了新的视角，并强调了在将其开发为饲料添加剂或治疗辅助剂时，需仔细考虑剂量和应用场景。未来的研究应纳入更广泛的细胞因子谱（如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10）分析，并利用更多动物样本以评估个体差异，同时结合分子通路分析，以更全面地阐明槲皮素在猪免疫系统中的确切作用机制。
