引言
肝细胞癌（HCC）是全球范围内最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一，其早期症状隐匿，多数患者确诊时已为晚期。因此，寻找用于早期诊断和干预的生物标志物及潜在治疗靶点至关重要。近年来，随着蛋白质组学技术的成熟，肿瘤标志物研究的焦点正从基因组学转向蛋白质组学。蛋白质可通过磷酸化、硝化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰（PTM）改变其活性，其中蛋白质磷酸化修饰是最常见且关键的PTM，在几乎所有的生命活动中都扮演着角色。本研究旨在通过整合定量蛋白质组学与TMT标记的定量磷酸化蛋白质组学，系统揭示HCC进展过程中的阶段特异性分子特征，阐明驱动恶性转化的关键蛋白及其PTM网络，并鉴定候选的核心生物标志物和治疗靶点。
材料与方法
研究从大连市公共卫生临床中心招募了40名受试者，收集了肝癌组织（HCT）、癌旁组织（ANT）和肝硬化组织（LCT）样本。采用相对定量蛋白质组学和TMT标记的定量磷酸化蛋白质组学技术对样本进行分析。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）进行功能富集分析，利用PhosphoSitePlus（PSP）数据库预测上游激酶，并从STRING数据库下载蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据用于网络评分和下游分析。此外，研究构建了一个多层次的综合评分体系，整合了蛋白表达差异、磷酸化验证、网络拓扑结构和生物学验证等多个维度的信息，以系统性地识别HCC中的核心驱动蛋白。
结果
蛋白质组与磷酸化蛋白质组差异表达谱
整合分析揭示了HCT中蛋白质丰度与磷酸化水平存在协同改变，而这种模式在ANT与LCT的比较中并不存在，表明肿瘤发生是一个非线性、多通路汇聚的过程。在HCT与ANT的比较中，共鉴定出2,156个差异表达蛋白（DEPs）；在HCT与LCT的比较中，鉴定出1,982个DEPs；而在ANT与LCT的比较中，仅发现100个DEPs。磷酸化蛋白质组学分析共鉴定出2,077条磷酸肽，分布于1,237个蛋白质上，包含2,425个磷酸化位点，其中磷酸丝氨酸（pSer）、磷酸苏氨酸（pThr）和磷酸酪氨酸（pTyr）的比例分别为87.34%、11.75%和0.91%。
核心驱动蛋白的筛选与功能富集
通过构建的多层次评分框架，研究从HCT与ANT、HCT与LCT的比较中分别筛选出排名前20的核心蛋白，并发现其中有12个蛋白是重叠的，被确定为HCC发生发展的候选共享驱动蛋白。它们包括：果糖-二磷酸醛缩酶B（ALDOB）、延胡索酰乙酰乙酸酶（FAH）、精氨基琥珀酸合成酶（ASS1）、细胞色素P450 2C8（CYP2C8）和细胞色素P450 4A11（CYP4A11）等。KEGG富集分析表明，这些核心蛋白显著富集于代谢通路、氨基酸生物合成、视黄醇代谢和类固醇激素生物合成等肝相关代谢通路。
磷酸化依赖的阶段性调控
一个值得注意的发现是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。在HCT与LCT的比较中，GAPDH的总蛋白丰度没有变化，但其磷酸化水平却显著降低，这表明在从肝硬化向HCC转变的关键阶段，GAPDH的功能可能主要受磷酸化这种翻译后修饰的调控。同样，ALDOB的磷酸化肽段在HCT中也显著减少。这些发现突出了磷酸化修饰在HCC进展中的特异性调控作用。
激酶-底物关系预测
为了阐明上游调控机制，研究利用PSP数据库对核心磷酸化蛋白进行了激酶预测。预测得到了包括核糖体S6激酶1（RSK1）、死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）和极光激酶A（AURA）在内的多个潜在调控激酶。值得注意的是，大多数预测的激酶-底物关系并未富集在相同的经典KEGG通路中，这暗示了在HCC进展过程中存在广泛的跨通路磷酸化信号重编程。这些预测为HCC中复杂的信号网络相互作用提供了新的见解，并提名了若干有待实验验证的调控轴。
讨论
本研究通过整合蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析，揭示了HCC恶性转化过程中蛋白质表达与磷酸化协同调控的核心枢纽蛋白和通路。与ANT和LCT之间的比较不同，HCT与ANT/LCT的比较显示了这种协调性变化，表明肝癌的发生和发展并非线性过程，而是由不同的驱动事件汇聚而成。研究鉴定出的12个重叠核心驱动蛋白主要富集于肝脏的核心代谢通路。
在脂质代谢层面，细胞色素P450家族酶CYP4A11和CYP2C8在HCT中均显著下调。CYP4A11的下调与先前报道一致，其表达可能与良好的预后特征相关。CYP2C8的下调则可能通过影响PI3K/Akt/p27Kip1轴来抑制HCC的恶性表型，同时其参与药物代谢的双重角色也使其成为指导药物选择的潜在靶点。
在氨基酸和碳水化合物代谢层面，ASS1和FAH的下调可能分别通过影响尿素循环/精氨酸合成以及酪氨酸分解代谢，导致有毒中间体积累和代谢重编程，从而在HCC的发生或维持中发挥作用。ALDOB的下调及其磷酸化水平的改变，是肝脏肿瘤代谢的常见特征，但其磷酸化修饰的功能意义尚不清楚。
尤为有趣的是GAPDH的调控模式。在HCT与LCT的比较中，其总蛋白量不变而磷酸化显著下调，提示细胞在从肝硬化向HCC转变的过程中，可能通过PTM网络主动抑制GAPDH的活性。这一发现为理解HCC的代谢适应提供了新视角。
此外，激酶预测提示了跨通路的磷酸化信号重编程。例如，MAPK通路的下游激酶RSK1被预测可能磷酸化ALDOB，从而连接生长信号与糖酵解代谢；细胞周期关键调控因子AURA激酶被预测可能调控GAPDH，连接细胞周期进程与代谢。这些间接的功能关联为预测的激酶-底物调控关系提供了潜在支持，并为已鉴定核心蛋白的调控机制提供了新的线索。
结论
本研究通过整合相对定量蛋白质组学和TMT标记的定量磷酸化蛋白质组学，首次系统描绘了HCT、ANT和LCT之间在蛋白丰度与磷酸化协同调控方面的差异，阐明了HCT进展的非线性、多通路汇聚特征，并鉴定出一组富集于肝脏核心代谢通路的关键驱动蛋白。从代谢重编程和翻译后修饰调控的角度，这些发现深化了对HCC发病机制的理解，并为识别阶段特异性生物标志物和治疗靶点提供了分子线索。核心蛋白如CYP4A11、CYP2C8、ASS1、FAH、ALDOB和GAPDH，尤其是ALDOB和GAPDH的异常磷酸化，是HCT新型生物标志物和靶向治疗的有希望的候选者。未来需要通过扩大样本量来验证这些发现，并开展进一步研究以 bridging 从基础科学到临床应用的 gap。
