保罗·布奇（Paula Bucci）|胡安·曼努埃尔·卡斯塔尼尼（Juan Manuel Castagnini）|米克尔·马丁内斯-纳瓦雷特（Miquel Martínez-Navarrete）|安娜·梅莱罗（Ana Melero）|埃米莉亚·费雷尔（Emilia Ferrer）|弗朗西斯科·J·巴尔巴（Francisco J. Barba）|达尼洛·坎特罗（Danilo Cantero）|劳尔·穆尼奥斯（Raúl Muñoz）|弗朗西斯科·J·马丁-基哈尔（Francisco J. Martí-Qijal）
瓦拉多利德大学化学工程与环境技术系可持续过程研究所，西班牙瓦拉多利德市Mergelina博士路，邮编47011
**摘要**
啤酒酿造过程中的副产品——啤酒糟（BSG），是一种富含生物活性成分的可持续资源，其中最重要的是具有强效天然抗氧化特性的阿魏酸（FA）。本研究采用了化学、酶法和热水解方法提取FA，并通过酶法和热水解工艺实现了高达97-98%的封装效率。将FA结合到先进的纳米递送系统中后，在体外实验模型（包括HaCaT细胞和人类真皮成纤维细胞HDF细胞以及3D重建的表皮）中显示出更好的稳定性、生物利用度和再生性能。这些系统能够促进伤口愈合（6小时内愈合50%，24小时内完全愈合），并降低活性氧水平94%，从而验证了其有效性。这项工作展示了循环经济模式的应用，将啤酒糟从废弃物转化为宝贵资源，为化妆品和制药领域的可持续应用开辟了新途径。
**引言**
近年来，公众和科学界普遍认为许多人类疾病可以通过从植物成分（如阿魏酸）中提取的植物化学物质来治疗（Kumar等人，2023年）。阿魏酸存在于多种植物的细胞壁中，也是啤酒糟中最丰富的抗氧化成分（Antonopoulou等人，2022年；Birsan等人，2019年；Shahidi和Yeo，2018年）。啤酒糟是指啤酒酿造过程中剩余的物质，由未完全发酵的麦芽或大麦颗粒以及滤除麦汁后的不溶性成分组成。由于其高纤维和蛋白质含量，啤酒糟常被用作牲畜饲料（Xiros和Christakopoulos，2012年）。全球每年啤酒糟的产量约为3900万吨，作为动物饲料的市场价值为每吨45.00美元（Lynch等人，2016年）。近年来，生物技术、制药和食品工业等多个领域都在研究啤酒糟的潜在价值并开发增值产品（Aliyu和Bala，2011年；Zeko-Pivač等人，2022年）。
阿魏酸因其在治疗多种疾病（包括皮肤疾病、癌症、衰老、糖尿病、心血管问题、神经保护及炎症等）中的疗效而受到越来越多关注（Zhai等人，2023年）。其抗氧化作用主要源于其酚核和不饱和侧链构成的共振稳定苯氧基自由基结构（Li等人，2021年）。阿魏酸是一些传统护肤药品中的主要活性成分，广泛用于预防和治疗皮肤疾病，同时也用于多种化妆品中（如保湿及抗衰老产品、面部清洁剂等，Stompor-Gorący和Machaczka，2021年）。尽管阿魏酸分子量小，具有利于皮肤吸收的理化特性，但由于易自氧化且半衰期较短，需要频繁使用，这影响了患者的依从性。因此，开发有效的递送系统至关重要。近期研究专注于创新方法以提高其稳定性和生物利用度（Das和Wong，2020a；Shekunov等人，2007年）。泡囊药物递送系统（如常规脂质体、ethosomes和transferosomes）也为提高药物经皮渗透提供了 promising 方案（Sguizzzo等人，2023年），但由于结构刚性缺乏灵活性，这些系统在皮肤深层渗透效果有限。超可变形脂质体（UL）通过添加边活性剂制成，可改善多种大分子药物的皮肤渗透性（Souto等人，2021年）。作为人体最大的器官，皮肤保护我们免受外部环境侵害（BAE等人，2015年；Bae等人，2015年；Lee等人，2016年）。皮肤由表皮和真皮两部分组成，其中真皮含有成纤维细胞、基质蛋白等物质（Zhou等人，2012年）。研究表明，人类皮肤成纤维细胞是真皮的主要成分，与角质形成细胞共同应对感染、炎症、光老化等皮肤问题（Sauce等人，2021年）。鉴于皮肤生物学功能的复杂性，体外实验对于研究毒素、化学物质和化妆品对皮肤的影响至关重要，因此需要寻找安全有效的天然产品来保护皮肤（Corti等人，2006年；Costa Duarte等人，2021年；Haq等人，2018年）。在这种背景下，超可变形脂质体可被结合到含有维生素C或视黄醇的抗衰老面霜中，这两种成分对皮肤再生和减少皱纹效果显著。UL的柔韧性使其能更深入皮肤层，增强这些成分的效果。该技术有潜力提升化妆品的功效，无需使用刺激性物质。
在皮肤测试方面，HaCaT（永生化人类角质形成细胞）和HDF（人类真皮成纤维细胞）已成为评估化合物毒性和生物活性的经典体外模型。这些细胞系为分析化学物质对皮肤的反应提供了可靠且可重复的平台，可详细检测细胞存活率、迁移性、抗氧化活性等关键指标（Cruz等人，2023年；Garg等人，2020年）。3D模型（如重建的表皮模型，Cruz等人，2023年）则提供了更真实的模拟环境，进一步增强了研究结果的可信度（Ma等人，2021a）。因此，体外模型在化妆品和药品开发中至关重要，可提前评估化合物的安全性和有效性。
**研究目的**
本研究旨在开发一种利用超可变形脂质体（UL）的高效递送系统，实现从啤酒糟中提取的阿魏酸在皮肤中的有效递送。通过克服传统递送方法的局限，该系统旨在提高阿魏酸的皮肤渗透性、稳定性和生物利用度。利用HaCaT和HDF细胞系以及3D重建的表皮模型，评估负载阿魏酸的UL在皮肤组织中的抗氧化和再生效果。该研究不仅希望挖掘阿魏酸在治疗皮肤疾病方面的潜力，还能推动啤酒糟的合理利用，促进啤酒酿造行业的可持续发展。研究成果有望为化妆品和制药领域带来创新应用，提供一种天然且有效的皮肤保护和再生方法。
**材料与方法**
2.1. 啤酒糟
西班牙加那利群岛“Compañía cervecera de Canarias”提供的啤酒糟先用纯净水清洗后，在80°C下干燥过夜，再使用自动微粉机研磨至0.4毫米粒径，最后储存在20°C下备用，最长可保存6个月。
2.2. 阿魏酸的定量与提取
根据Bucci等人（2024年）的方法进行水解处理以释放阿魏酸，包括化学（碱性水解）、酶法和热水解（亚临界水）三种工艺。碱性水解包括先在120°C下用72% H2SO4处理15分钟，再在40°C下用2%氢氧化钠溶液处理4小时；酶水解使用黑曲霉（Aspergillus niger）的AnFae1和迪基酵母（Dickiya zeae）的endoxylanase复合酶；热水解在220°C下进行2秒以高效提取阿魏酸。阿魏酸的定量采用UHPLC-MS技术，方法参考Bucci等人（2024年）的研究。
2.3. 纳米载体的制备与表征
2.3.1. 纳米 encapsulation 及效率
超可变形单层脂质体（UL）由大豆磷脂酰膽碱（SPC）和胆酸钠（NaChol，Sigma Aldrich，西班牙）按6:1的比例混合，溶解在氯仿∶甲醇（1:1，v/v）中。有机溶剂在旋转蒸发器中40°C、190 rpm下蒸发，形成薄膜。薄膜用含有最高浓度阿魏酸的提取液（每毫升提取液含40毫克SPC）重新水化。随后将脂质体分散液进行超声处理（Mastersizer 2000系统，Hydro 2000单元，Malvern Instruments），共三个30秒循环，每个循环间隔30秒，以减小脂质体尺寸和层状结构。为降低超声过程中的温度，样品在整个过程中保持在冷却条件下。
2.3.2. UL 的表征
采用ZetaSizer Nano Series（Malvern Instruments，英国）仪器测定UL的粒径、多分散指数（PDI）和ζ电位。动态光散射（DLS）法测量平均粒径和PDI，所有数据均为三次实验的平均值（n=3）。
2.3.3. 长期稳定性预测
由于UL属于热力学不稳定的胶体系统，通过监测物理化学性质（如平均粒径、PDI、ζ电位及阿魏酸保留率/封装效率）来评估其稳定性，检测时间为90天。除常规储存条件外，还进行了加速温度应力测试（40-45°C）以观察早期变化。由于制剂为水基分散液，相对湿度不是主要不稳定因素，因此主要通过升高温度（40-45°C）进行加速测试。通过线性回归计算Log（剩余阿魏酸含量，%）与时间（h）的关系，进而计算半衰期（t90和t1/2）。
2.4. 细胞培养
使用两种细胞类型进行毒性测试：人类角质形成细胞（HaCaT细胞，参考编号300493，Bionova批次0003798）和人类真皮成纤维细胞（HDF细胞，P10858，Innoprot，比斯开亚，西班牙）。细胞在37°C、5% CO2和95%相对湿度下培养，培养基为Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含有10%热灭活胎牛血清（FBS，Gibco，Invitrogen，美国）、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和0.1%两性霉素B。培养基每48-72小时更换一次。
2.4.1. 体外细胞毒性评估
在96孔平底微孔板中每孔接种20,000个HaCaT细胞或15,000个HDF细胞，培养24小时后进行细胞毒性测试。当细胞密度达到80%时，移除培养基并加入含有不同浓度FA提取物的新鲜培养基，浓度范围从3.13%到25%（v/v）。由于样品溶解在miliQ水中，在稀释到培养基之前加入了0.9%（w/v）的NaCl，以获得等渗培养基。每种处理方法得到的FA最大浓度被视为100%。研究了游离形式（FA）和纳米包封形式（ULs_FA）的提取物，并使用不同浓度的商业FA标准品进行比较。对于MTT检测，移除含有提取物的培养基，加入含有0.5 mg/mL MTT的新鲜培养基，然后细胞在37°C下孵育1小时。接着，去除上清液，加入DMSO，并使用BioTek Synergy H1多功能读数器（Agilent，CA，美国）在570 nm处测量吸光度。报告的结果是三次独立实验（n=3）的平均值。
2.5 皮肤刺激测试（SIT）
为了确保所得提取物的安全性，使用商业3D皮肤模型“SkinEthic RHE/Human Epidermis”（EpiSkin™，法国里昂）评估了皮肤刺激作用。该测试按照OECD测试指南439进行（测试编号439：体外皮肤刺激：重组人表皮测试方法，2021年），使用EpiSkin公司提供的验证标准操作程序（SOP）。简而言之，在组织平衡后（37°C下2小时），在组织顶部加入16 μL的不同配方，并在20°C下孵育42分钟。然后，用1 mL PBS清洗组织25次，并在37°C下再次孵育42小时。此时，加入1 mg/mL的MTT并继续在37°C下孵育3小时。最后，用异丙醇提取甲苯胺蓝（formazan），并使用BioTek Synergy H1多功能读数器（Agilent，CA，美国）在570 nm处测量吸光度。该模型能够可靠地区分对皮肤有刺激性的产品和无刺激性的产品，因此可用于根据联合国全球统一系统（GHS）对皮肤刺激风险进行分类。为了确保测试的可重复性，使用了两个组织样本，结果表示为平均值±标准差（SD）。己烷和PBS分别用作溶剂参考和阴性对照。这种实验选择是为了本研究设计的比较目的，而不是按照指南SOP定义的监管阳性对照。
2.6 活性氧（ROS）生成量的测量
使用2,2′-偶氮（2-氨基丙烷）二盐酸盐（AAPH）在体外诱导氧化应激，并通过在氧气存在下偶氮化合物的热分解生成过氧化基团。HaCaT（2.5 × 10^5细胞/孔）和HDF（1.5 × 10^5细胞/孔）细胞在添加了10% FBS的D-MEM培养基中的96孔板中培养。当细胞密度达到85%时，用先前在细胞毒性测试中确定为无毒的FA配方（表1）替换培养基，并在无血清培养基中加入AAPH（20 mM）进行刺激。暴露24小时后，去除AAPH，细胞在含有20 μM 2’,7’-二氯二荧光素二醋酸盐（DCFH-DA）的新鲜培养基中孵育30分钟，温度为37°C，环境为暗处。使用BioTek Synergy H1多功能读数器（Agilent，CA，美国）在485/535 nm的激发/发射波长下测量荧光。结果相对于溶剂对照表示。实验独立重复进行，每个测试浓度进行了24次技术重复。
2.7 伤口愈合和迁移
鉴于FA在真皮治疗中的有效特性，根据Vang Mouritzen和Jenssen的方法（Vang Mouritzen和Jenssen，2018）进行了迁移测试。使用Ibidi Culture-Insert 2 Well系统（Ibidi GmbH，德国格拉费尔芬）在24孔板中创建线性伤口，该系统通过在处理过的板底粘附来阻止细胞在预定区域的生长。简而言之，在每个孔中加入最终体积为70 μl的细胞悬液，HaCaT细胞的细胞浓度为3×10^4细胞/mL，HDF细胞的细胞浓度为1.5×10^4细胞/mL，培养条件为37°C和5% CO2，观察到每个细胞系的细胞层形成达到100%的密度。在加入提取物之前，先用最终浓度为10 μg/mL的丝裂霉素C预孵育细胞2小时，以防止细胞增殖并确保细胞迁移而不是生长，遵循Vang Mouritzen和Jenssen的方法（Vang Mouritzen和Jenssen，2018）。随后，小心地移除每个插入物，确认细胞层仍然粘附在孔壁上。用PBS 1X清洗细胞层以去除未粘附的细胞。最后，向孔中加入含有FA配方（表1，浓度为12.5%（v/v）的1 mL DMEM培养基。使用ULs-Blank、FA_ST；ULs_FA_ST和DMEM培养基作为对照。24小时后，使用ZEISS Axio Vert显微镜以10倍放大倍数记录图像。最后，使用ImageJ软件（NIH，威斯康星州，美国）分析图像以获取有关迁移特征的信息。
为了确保细胞周期停滞，如Martí-Quijal等人（Martí-Quijal等人，2024）先前所述，使用流式细胞术研究细胞周期。将细胞接种在6孔板中并孵育24小时。然后，在相同的条件下加入丝裂霉素C。孵育时间后，用TRYPsin处理细胞，随后在4°C下用Vindelov的PI染色溶液孵育30分钟，环境为暗处。之后，使用BD LSRFortessa流式细胞仪（BDBiosciences，新泽西州富兰克林湖）分析每个样本的20,000个事件。染色溶液由10 mM Tris、0.1% Triton X-100、40 μg/mL RNase、50 μg/mL PI和10 mM NaCl在PBS中组成。该程序在三个独立的实验中重复进行。
3.1 FA的释放与不同的水解处理
使用不同的水解方法基于所需的时间和能量以及所需材料（如溶剂和酶）来优化并最大化FA的提取产量。如Bucci等人（2024）报告的，三种处理方法得到的FA浓度存在显著差异。表2总结了水解处理的特征及其各自的FA产量。实验重复三次。
表2. 水解处理的特征和产量
水解处理
时间（小时）
材料及条件
产量（g FA/Kg BSG）
化学（Ch）
> 5
用硫酸（H2SO4 72%（w/w）预处理和氢氧化钠（NaOH 0.1 M）碱性处理
5.5 ± 0.6
酶法（Enz）
2 - 4
结合AnFae1（UniProtKB-A2QSY5，来自Aspergillus niger CBS 51）和Endoxylanase from Dickeya zeae Ech586（GH30）。水解在25°C下进行
4.3 ± 0.6
水解（Hyd）
使用亚临界水（SW）条件，反应条件为210°C和15 MPa，反应时间约为2秒
7.2 ± 1.1*
对于100 kg BSG/m3的BSG溶液
3.2 ULs_FAP的粒径、粒径分布和稳定性
研究了活性游离纳米分散体（Free FA）和纳米包封FA（ULs_FA）分散体的z平均直径和多分散指数（PdI）。表1中提到的所有纳米分散体每mL FA都含有40 mg的SPC作为脂质辅料和6.6 mg的NaChol。FA通过每种水解处理得到最大包封浓度：ULs_FA_ST（800 μg/mL）；ULs_FA_Ch（520 μg/mL）；ULs_FA_Enz（420 μg/mL）和ULs_FA_Hyd（714 μg/mL）。所有配方的粒径和PdI分别为102 ± 0.5 nm（p> 0.05）和0.51 ± 0.045（p> 0.05）。PdI值与文献报告一致（Das和Wong，2020b）。在生产后评估了FA在ULs中的包封效率，并监测了其生产后的稳定性。所有配方中游离活性的包封效率最高，FA含量百分比在化学水解中为92%至95%，在酶法和水解法中为97%至98%。为了了解配方保持FA包封的能力并预测其稳定性，计算了每种配方的保质期（t90），即浓度减少10%的时间点（t90），以及半衰期（t1/2），即浓度减少50%的时间（t1/2）。此外，还研究了90天内的z平均直径（约100 nm）和PdI（<0.7），如表S1所示。从报告的数据与文献（Sguizzato等人，2023）比较可以看出，ULs能够长时间保持FA的稳定性。还观察到，90天后的纳米包封后的粒径和PDI值与初始值没有显著差异。这证实了ULs作为FA递送系统的角色。
3.3 配方对细胞活力的影响
使用HaCaT和HDF细胞系通过MTT检测评估了游离和包封提取物对细胞毒性的影响。尽管对不同水解方法得到的提取物中的FA浓度进行了量化，但这些提取物可能含有共提取的化合物，如其他酚类和基质衍生物片段，这些成分可能会影响表观的包封效率和生物学反应。这些成分可能部分分配到脂质相中，影响胶体稳定性，和/或在较高剂量下影响细胞反应，包括细胞毒性。为了最小化混杂效应，所有生物测定都包括空白的UL对照和剂量匹配的条件；然而，未来工作需要通过HPLC/UPLC定量FA标准品和基于LC-MS的共提取物成分谱分析来全面纯化/剖析FA提取物，以完全区分FA的特定效应和潜在的基质贡献。实际上，在每种水解处理中获得的最大FA浓度分别为：水解法（714 μg/mL）、化学水解法（520 μg/mL）和酶法水解法（420 μg/mL）。在两种细胞系中，当FA被纳米包封时，细胞活力更高（图1 - b, d, f, h, j, l, n, p）。然而，当检查来自不同水解方法的纳米配方时发现了差异。如图1所示，用化学方法处理的FA处理的HDF和HaCaT细胞的活力显著下降（p < 0.05），无论是游离活性形式（c, k）在浓度> 8.25%（对应于42.9 μg/mL的FA）还是包封在ULs中（d, l）在浓度> 16.25%（对应于84.5 μg/mL的FA）。对于HDF细胞，在最高剂量（25%，105 μg FA/mL）下所有FA配方都表现出毒性，除了ULs_FA_Enz，与对照组没有显著差异（图1-f, n）。相比之下，对于HaCaT细胞，无论是游离还是包封形式的FA标准品在测试浓度下都没有表现出任何显著毒性。如图所示，酶处理产生的提取物相比热处理和化学处理更为安全。相反，化学提取法被证明是恢复FA的最毒方法。
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图1.脂肪酸（FA）和超临界流体（ULs）对（a-h）人真皮成纤维细胞（HDF）和（i-p）人角质形成细胞（HaCaT）细胞活力的影响。(a, i) FA_ST；(b, j) ULs_FA_ST；(c, k) FA_Ch；(d, l) ULs_FA_Ch；(e, m) FA_Enz；(f, n) ULs_FA_Enz；(g, o) FA_Hyd；(h, p) ULs_FA_Hyd。结果以平均值（百分比）±标准差表示。与游离提取物相比，FA纳米封装显著提高了两种细胞系的细胞活力。这可以解释为纳米封装通过防止生物活性化合物的降解（Das和Wong，2020c）来提高其稳定性和生物利用度。此外，已有研究表明脂质体本身也可以增加细胞活力（Bedoya-Agudelo等人，2024；Pisani等人，2023），这可能也有助于降低封装提取物的细胞毒性。另一方面，还观察到FA提取方法显著影响了提取物的细胞毒性。在这方面，纳米封装的酶提取物（ULs_FA_Enz）显示出了最高的细胞活力，尤其是在HDF细胞中。这可以归因于酶水解是一种温和且选择性的提取方法，能够保持化合物的生物活性（Costa等人，2020；Lemes等人，2022）。相比之下，化学提取物在游离和封装形式下均表现出细胞毒性（FA_Ch和ULs_FA_Ch）。在这种情况下，提取过程中残留碱的存在或在严酷条件下产生的有毒化合物可以解释这种行为。最后，还观察到两种细胞系之间存在差异：总体而言，HaCaT细胞比HDF细胞更具抵抗力。这里获得的结果与文献中的报告完全一致。Valério等人（2021）研究了从玉米纤维中提取的富含FA的多种酶提取物（经过140或165°C下40或120分钟的热水预处理）和化学提取物（碱性水解）在接触接下来的96小时后对Caco-2细胞（汇合和非分化状态）的细胞毒性。研究发现，无论是否经过预处理，酶水解提取物在测试浓度范围（0.078 mg/mL至10 mg/mL）内均未表现出细胞毒性。然而，碱性提取物在浓度高于1 mg/mL时表现出细胞活力降低，作者认为这是因为这种提取方法也可能提取了有害化合物。
为了确认所获得提取物的安全性，使用了SkinEthic重组人表皮（RHE）。EpiSkin™ “SkinEthic RHE”（EPISKIN实验室，法国里昂）是一种体外人表皮模型，由在空气-液体界面培养的正常人角质形成细胞在惰性聚碳酸酯膜上形成（Pellevoisin等人，2018）。该模型可用于预测和分类局部应用的样品的皮肤刺激潜力。它已经通过科学验证，并获得了作为体内皮肤刺激测试替代品的监管批准（测试编号439：体外皮肤刺激：重组人表皮测试方法，2021）。该模型按照质量参考标准ISO 9001生产，确保了表皮组织的可追溯性和再现性。组织暴露于FA制剂的结果如图2所示。只有FA化学制剂（FA_Ch和ULs_FA_Ch）与未经处理的细胞相比在细胞活力方面表现出显著差异（p < 0.05）。此外，观察到游离提取物（FA_Ch）比封装提取物（ULs_FA_Ch）更具毒性（细胞活力分别为70 ± 6% vs 79 ± 5.9%）。这与在2D模型中获得的结果一致，因为化学制剂最具细胞毒性，而封装制剂比游离制剂危害较小。
为了比较酶提取物和水热提取物，无论是游离形式还是封装形式，都与对照组相比均未发现显著差异。然而，观察到封装提取物的细胞活力值略高（酶提取物为86 ± 7.8% vs 89 ± 5.9%，水热提取物为90 ± 7.2% vs 97 ± 4.5%）。这再次与之前在单层HaCaT和HDF细胞中观察到的结果一致。刺激性化学物质通过其降低细胞活力至特定阈值50%的能力而被识别（Ma等人，2021b）。尽管化学提取物降低了细胞活力，但在该重组人表皮模型中，没有任何一种测试制剂引起皮肤刺激。据我们所知，目前没有其他文章测试啤酒副产品提取物在人体皮肤3D模型上的效果。然而，已经测试了其他富含多酚的制剂。在这方面，Pinto等人（2021）研究了通过亚临界水提取（220°C下30分钟，压力40巴）从栗壳中提取的提取物在3D人体皮肤模型（Episkin™ SkinEthic™ HCE）上的应用，发现与对照组相比无显著差异。同样，Rodrigues等人（2015）测试了用20 mL水和乙醇（1:1，v/v）或乙醇在EpiSkin™模型（大型模型）和SkinEthic™ HCE模型上通过浸渍法获得的不同咖啡银皮提取物，发现所有提取物的细胞活力与对照条件（PBS）相似。
为了研究FA对ROS生成的影响，选择了所有研究制剂中的两种无毒浓度（6.25%和12.5%（v/v））。通过使用H2-DCFDA的荧光测定法测量了细胞内的ROS生成。与20 mM APPH处理的细胞（对照组+）相比，所有FA制剂都观察到ROS生成显著下降（p < 0.05）。根据获得的结果，12.5%的纳米封装提取物孵育的细胞显示出最高的抗氧化活性，其中ULs_FA_Hyd在HaCaT和HDF细胞中的抗氧化活性最高，分别减少了91%和94%的ROS生成（相对于阳性对照AAPH 20 mM）。然而，对于两种细胞，自由FA提取物在6.25%浓度下显示出最低的减少幅度。关于对HaCaT细胞的影响，FA_Enz的抗氧化活性最低，其次是FA_Ch和FA_Hyd，分别减少了31%、44%和55%的总ROS生成。对于HDF细胞，FA_Ch的抗氧化活性最低，其次是FA_Enz和FA_Hyd，分别减少了39%、48%和54%的总ROS生成。在所有情况下，12.5%浓度下的ROS生成减少更明显，表明抗氧化活性依赖于提取物浓度。还观察到封装提取物表现出比游离形式提取物更强的抗氧化能力。此外，水热提取物与其他制剂相比具有更高的抗氧化活性，这可以归因于其中的高阿魏酸含量（714 μg/mL），高于化学提取物（520 μg/mL）和酶提取物（420 μg/mL）。另一方面，未加载ULs的非封装提取物无法逆转AAPH在HaCaT和HDF细胞中诱导的氧化应激，表明抗氧化效果可归因于制剂中的FA。这些结果表明，封装提取物的增强抗氧化能力可能是由于FA在制剂中的稳定性得到改善，因为脂质体有助于防止其降解（Das和Wong，2020d）。
这些发现与其他研究人员的报告一致，他们也观察到将多酚封装在脂质体中可以增强提取物的抗氧化活性。例如，Gheybi等人（2023）将水苏木素封装在脂质体中，并评估了其对抗Cd引起的ROS增加的抗氧化活性，使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯。研究表明，含有2.5、5和10 μM浓度水苏木素的脂质体将MRC5和A549细胞中的ROS生成降低到与50 μM自由水苏木素相当的水平。同样，Sinisgalli等人（2020）评估了Capsicum annuum L.（var. Senise）的乙醇提取物的抗氧化能力，该提取物含有多种多酚（黄酮、黄酮醇、酚类和黄烷-3-醇），在暴露于5 mM叔丁基过氧化氢的HepG2细胞中。他们还分析了将乙醇提取物封装在脂质体中的效果。他们的发现表明，游离提取物和封装提取物都具有显著的抗氧化活性，其中封装提取物的效力是游离提取物的两倍。最后，De Luca等人（2022）研究了将没食子莓的乙醇提取物封装在脂质体中的效果及其对AAPH应激3T3-L1细胞抗氧化活性的影响。这些提取物主要由花青素和两种黄酮类化合物（myricetin-3-O-rhamnoside和myricetin-3-O-galactoside）组成。结果表明，无论是游离提取物还是封装提取物都降低了ROS水平，其中封装提取物的效果更为明显，其ROS水平接近对照组。这些结果也与之前研究一致，这些研究报道了FA在AAPH诱导的氧化条件下的抗氧化潜力（Barygina等人，2019），表明FA可以保护和防止AAPH引起的氧化应激和损伤，且在ULs纳米封装中保护作用更强（图2）。最后，这些结果也很有前景，因为研究表明FA可以提高L-抗坏血酸和α-生育酚制剂的化学稳定性，从而增强其光保护性能（Zduńska等人，2018）。
在伤口愈合过程中，细胞增殖并迁移以闭合伤口并恢复上皮层（Gonzalez等人，2016）。为了测试细胞集体迁移，采用了一种双方法，在高度控制的体外条件下分别对人角质形成细胞和人皮肤成纤维细胞进行测试，以模拟和研究不同FA制剂对迁移过程的影响。该技术包括使用2孔硅胶插件创建一个薄的线性“伤口”（制造一个间隙），然后定期拍摄填充间隙的细胞图像（Cory，2011）。发现在不同时间点（T0、T2、T4、T6、T8和T24小时）暴露于无FA活性制剂和ULs.fa制剂的人角质形成细胞和成纤维细胞之间的迁移率存在可测量差异（相对于对照组（未处理的细胞）。然后，通过计算自由细胞区域的减少来计算细胞迁移率。对于这项测定，选择了12.5%（v/v）的浓度，因为该浓度被认为无毒。此外，为了研究这些制剂促进伤口闭合的能力是由于细胞迁移还是细胞增殖，使用丝裂霉素C阻断了细胞周期（图S1）。如图4（a-b）所示，结果表明，在两种细胞系中，封装在ULs中的样品以时间依赖的方式更有效地促进了伤口的逐步闭合。然而，观察到FA_Hyd是最有效的游离活性制剂，在4小时（T4）时与迁移研究开始时（T0）相比，伤口闭合有显著差异（p < 0.05），并在6小时（T6）时实现了超过50%的闭合。另一方面，对受伤区域的定量显示，暴露于ULs_FA_Enz和ULs_FA_Hyd的HaCaT和HDF细胞在孵育的前6小时（T6）内迁移到受伤区域的速度更快（> 50%），而暴露于ULs_FA_ST和ULs_FA_Ch的细胞则不然。确实，在24小时的暴露时间后，无细胞区域完全被这些配方（ULs_FA_Hyd和ULs_FA_Enz）处理的细胞覆盖。此外，单独使用脂质体也被发现能够促进愈合（见图4）。这可以解释为什么封装提取物比游离提取物具有更高的效率。因此，脂肪酸（FA）的暴露诱导了细胞迁移和伤口闭合，而当药物被纳米封装时，这种效果得到了增强（见图S2和图4）。
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图4. 在HaCaT（a）和HDF（b）细胞中进行的伤口愈合实验，测试了不同的脂肪酸配方。无细胞区域随时间的条形图，假设伤口宽度为100%。通过测量剩余的无细胞面积并将其表示为初始无细胞面积的百分比来评估伤口闭合情况。三次独立实验的结果以无细胞面积百分比的平均值±标准差表示。* p值在T2、T4、T6、T8和T24时间点小于0.05。
这些结果与文献中的报告一致。例如，Ramona Memete等人（2023年）研究了从桑树中提取的多酚成分及其在脂质体中的封装对nHDF细胞的愈合潜力。他们的发现表明，在48小时时，脂质体封装的提取物比游离提取物更有效。具体来说，封装提取物在48小时时实现了99.72%的伤口闭合率，而游离提取物仅为93.81%。此外，他们还观察到空脂质体也对愈合过程有贡献，因为它们的愈合效果优于对照组（分别为94.20%和82.37%）。同样，Firoznezhad等人（2023年）研究了通过超声波辅助的水醇法提取的Echium amoenum提取物在分散形式和脂质体封装形式下对HaCaT细胞的愈合能力的影响。该提取物主要由羟基肉桂酸、黄酮类化合物和黄烷-3-醇组成。他们的结果表明，将提取物封装在脂质体中显著增强了其愈合特性。48小时后，用脂质体封装提取物处理的细胞几乎完全覆盖了伤口表面，而用分散提取物处理的细胞仍有0.4厘米需要愈合，而初始宽度为1.7厘米。作者将封装提取物的效果提升归因于脂质体促进与细胞相互作用的能力，有助于活性分子的进入并使其发挥有益作用。
这项研究为利用BSG作为脂肪酸的来源提供了一条可持续的途径，并证明了将这种生物活性成分纳入用于皮肤递送的脂质体（ULs）中的可行性。一个关键优势是综合评估了脂质体的物理化学特性和在皮肤相关体外模型中的生物性能，从而能够在受控条件下初步评估安全性和有效性趋势。然而，这项工作也存在局限性。首先，目前的结论基于体外实验，应通过体外皮肤模型和/或体内研究来进一步验证，以更好地了解渗透性、代谢和复杂的组织反应。此外，稳定性评估仍受时间和条件的限制；长期监测和温度应力测试将进一步提高配方的稳健性。最后，虽然量化了脂肪酸的浓度，但对水解产物进行更详细的成分/纯度分析将有助于区分脂肪酸的特定效应与其他共提取组分，并支持批次间的重复性。这些方面将在未来的工作中得到解决。
**结论**
这项研究表明，BSG是一种有价值的脂肪酸来源，作为一种天然抗氧化剂，在化妆品、美容产品和制药行业中具有很大潜力。我们的研究探索了三种不同的提取方法——化学提取、酶法提取和水热提取——以从BSG中回收脂肪酸。将脂肪酸纳米封装在超可变形脂质体（ULs）中进一步增强了其抗氧化和再生特性，这通过体外实验中观察到的细胞活力提高和细胞毒性降低得到了证实。值得注意的是，酶法和水热法提取的脂肪酸的封装效率最高，封装效率在97%到98%之间。此外，纳米封装脂肪酸配方的保质期延长至188天，显示出显著的稳定性，特别是对于用酶法和水热法提取的脂肪酸封装的ULs。结果还表明，用酶法和水热法提取的纳米封装脂肪酸在促进伤口愈合和细胞再生方面表现出更优的性能，在HaCaT和HDF细胞中6小时内实现了超过50%的伤口闭合率，并在24小时内实现了完全闭合。此外，封装在ULs中的脂肪酸显著减少了活性氧（ROS）的产生，ULs_FA_Hyd在HDF细胞中将ROS水平降低了94%，远高于游离脂肪酸的效果。总体而言，将脂肪酸纳入创新递送系统（如ULs）中可以显著增强其治疗效果，为合成抗氧化剂提供了有前景的替代方案。这种方法不仅推动了天然生物活性成分的研究进展，还通过重新利用丰富的农业工业副产品为循环经济做出了贡献。这些过程的可扩展性为进一步的工业合作和在皮肤治疗中的应用提供了机会，有可能将BSG从废弃物转化为生物医学和化妆品领域的宝贵资源。
**作者贡献声明**
Raúl Muñoz：撰写、审稿与编辑、监督、资源提供。
Danilo Cantero：撰写、审稿与编辑、资源提供。
Francisco J. Marti-Quijal：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。
Juan Manuel Castagnini：撰写、审稿与编辑、验证、监督、方法学设计、实验设计、数据管理、概念化。
Paula Bucci：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、数据管理、概念化。
Ana Melero：撰写、审稿与编辑、资源提供、方法学设计。
Miquel Martínez-Navarrete：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析、数据管理。
Francisco J. Barba：撰写、审稿与编辑、验证、资源提供。
Emilia Ferrer：撰写、审稿与编辑、资源提供、概念化。
**未引用参考文献**
Bae等，2015；Test No. 439，2021。
**数据可用性**
支持本研究结果的数据可应第一作者的要求提供。
**资金支持**
本项目得到了BiOBreW项目的资助，该项目由欧盟的Horizon MSCA 2021-PF-01研究与创新计划资助（授予协议号101065428）。本研究还部分得到了AGROALNEXT计划（AGROALNEXT/2022/060 - 开发和优化从微藻、昆虫、农业食品废弃物和副产品中提取油脂和蛋白质的创新和可持续工艺：生物特性评估（EXTRAOLIOPRO）的支持，该计划得到了MICIU的资助，并得到了欧盟NextGenerationEU（PRTR-C17.I1）和瓦伦西亚自治区政府的支持。最后，M.M-N感谢瓦伦西亚自治区政府通过ACIF基金（Conselleria d’Innovació, Universitats, Ciència i Societat Digital，参考号CIACIF/2022/341）提供的财政支持。
作者感谢西班牙国家研究机构（Agencia Estatal de Investigación）在Project TED2021-129837B-C42项目中的财政支持。该项目还得到了卡斯蒂利亚-莱昂地区政府（Spain）和EU-FEDER计划（UIC379）的支持。Danilo Cantero还获得了西班牙科学、创新与大学部（Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades）的“Beatriz Galindo”奖学金（BEAGAL18/00247）的支持。
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