张家冲|吴金迪|夏亚楠|杨旭进
内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018，中国
摘要
微生物群落在风干肉的风味形成中起着核心作用；然而，在相同的自然条件下，不同的原始底物是否会产生相似的微生物组合及其代谢产物，目前尚未得到解答。我们假设尽管环境条件相同，牛肉和羊肉中的微生物-代谢物相互作用网络仍会存在差异。本研究使用16S rRNA基因扩增子测序结合衍生化GC-MS代谢组学技术，分析了在内蒙古锡林郭勒盟相同自然条件下生产的风干牛肉干和风干羊肉干。两种产品显示出高度相似的微生物群落结构，以乳杆菌（17–19%）和盐单胞菌（13–16%）为主，但观察到与底物相关的富集现象：风干牛肉干中以葡萄球菌为主，而风干羊肉干中则以瘤胃球菌和肠杆菌为主。代谢组学分析显示了明显的物种间差异，838种共有代谢物中有404种存在显著差异（VIP > 1，P < 0.05），主要涉及氨基酸、有机酸和脂质相关化合物。基于中心对数比率转换和Spearman等级检验（含FDR校正）的相关性分析揭示了优势属之间的正负互补关联模式。例如，盐单胞菌和科库里亚属主要与核心代谢物呈正相关，而瘤胃球菌、沙雷氏菌和梭菌属则呈负相关，形成了协调的代谢互补网络。风干牛肉干和风干羊肉干中涉及的特定代谢物不同，表明微生物-代谢联系受到底物的影响。这些发现表明，尽管微生物框架相似，原材料组成仍会重塑代谢结果，为传统风干肉的物种特异性风味形成提供了机制上的见解。
1. 引言
风干发酵肉制品在内蒙古、南美洲和欧洲等地广泛消费，因其较长的保质期和通过自然干燥及自发发酵形成的独特感官特性而受到重视（Niu等人，2023；Zhang等人，2024c；Zhang等人，2017）。在西方国家，也研究了意大利布雷索拉等传统干腌肉制品的营养成分、香气特征及加工相关的生化变化（Lopez等人，2024）。关于干发酵香肠的研究表明，脂解和蛋白水解有助于挥发性化合物的形成，突显了底物组成和微生物或化学过程在风味形成中的共同作用（Almeida等人，2024）。在此过程中，复杂的微生物群落定植于肉基质中，驱动一系列生化转化，产生多种挥发性和非挥发性化合物，直接影响产品的风味和质量（Hu等人，2022）。因此，越来越多的人关注微生物群落和底物组成如何共同影响发酵肉的风味形成（Zhou等人，2022；Gabriele等人，2022）。猪肉、牛肉和羊肉的发酵香肠表现出不同的挥发性特征和感官特性，反映了原材料组成和发酵过程中底物依赖性的代谢转化差异（Xie等人，2025）。
风干肉的微生物生态系统具有动态性和组成异质性，受肉类型和物理化学性质等内在因素以及环境条件和传统加工工艺等外在因素的影响（Zuo等人，2023）。宏基因组分析揭示了腌制肉系统中的多样细菌和真菌群落，其中变形菌门在某些牛源产品中的相对丰度约为78%（Sun等人，2022b；Zuo等人，2023）。代谢网络在底物转化中起核心作用，因为蛋白水解和脂解活动释放氨基酸和游离脂肪酸，为下游风味合成提供前体（Liu等人，2023a）。由于不同物种的蛋白质和脂质组成不同，底物的可用性可能有所不同，从而导致不同的微生物代谢产物和风味特征（Mu等人，2024；Wang等人，2024c）。区分肉种的影响与环境及加工因素的影响仍然具有挑战性（Liu等人，2022b）。不同物种的肌肉在物理化学性质上存在差异，包括脂质组成、脂肪酸分布、游离氨基酸含量和氧化稳定性，这些因素可能影响微生物代谢和挥发性化合物的形成。最近的多组学研究（如Wang等人，2021b；Jiang等人，2022；Wang等人，2024b）描述了微生物群落和风味相关化合物的特征，但通常仅针对单一肉类型或地理上不同的生产系统。在许多情况下，牛肉、羊肉或牦牛肉制品来自不同的生产单位，这些单位在盐的使用、干燥工艺、储存条件和微气候环境方面存在差异。这种变异性使得难以区分动物物种、加工工艺和环境因素的各自贡献。因此，原材料组成对微生物-代谢差异的具体影响尚未得到充分解析。
因此，跨动物物种的比较分析成为阐明发酵肉系统中保守和差异性微生物-代谢机制的有效策略。先前的研究表明，不同动物物种的发酵肉制品可能表现出不同的挥发性特征和特征性生物标志物（Liu等人，2022b；Man等人，2023）。很少有研究采用配对采样方法，在相同的自然干燥条件下同时处理牛肉和羊肉。本研究选择在内蒙古锡林郭勒盟相同自然条件下生产的风干牛肉干和风干羊肉干作为研究对象，通过16S rRNA基因测序结合衍生化风味代谢组学分析，比较细菌群落组成和风味相关代谢物谱型。通过将微生物群落分析与代谢物分析结合在配对生产设计中，本研究旨在阐明优势细菌类群与特征性风味相关代谢物之间的关联，揭示风干发酵肉中物种依赖性风味差异的微生物基础。
2. 材料与方法
2.1 样品采集与研究设计
本研究采用配对采样设计，每个生产家庭被视为一个生物学重复（n = 3）。每个家庭同时生产风干牛肉干和风干羊肉干，因此被视为一个实验单元。样品来自内蒙古自治区锡林郭勒盟苏尼特左旗的三个独立手工艺家庭。这些家庭遵循传统的当地方法，在自然环境中生产风干肉制品。肉条悬挂在自然通风的环境中干燥，不使用人工加热、熏制、接种发酵剂或控制湿度。每个家庭分别无菌采集一个风干牛肉干样本（苏尼特黄牛，屠宰年龄18–24个月）和一个风干羊肉干样本（苏尼特羊，屠宰年龄6–12个月），形成风干牛肉干-风干羊肉干样本对。根据现场调查和与生产者的沟通，每个家庭的风干牛肉干和风干羊肉干采用相似的传统工艺处理，包括相似的盐用量、切割大小、干燥时间和储存条件。因此，动物种类是本研究的主要考察因素。
采样在两次时间间隔相近的情况下进行，以减少单批次带来的变异。每个家庭采集两个独立的生产批次，共获得十二个物理样本（六个风干牛肉干样本和六个风干羊肉干样本）。同一家庭的样本被视为时间重复，而生物学重复在家庭层面定义（n = 3）。对于微生物群落分析，每个家庭和肉类型的两个批次在提取DNA前进行均质化，以获得该生产单元的代表性微生物群落谱型。而对于风味组学分析，则在单个批次样本上进行，以保留代谢物谱型的样本级变异。统计分析在家庭层面进行平均，使有效的生物学重复对应于三个独立的生产家庭。为确保可追溯性，采用了结构化的编码系统。牛肉样本标记为JB（牛肉干），羊肉样本标记为JM（羊肉干）。第一位数字表示采样时间（1或2），第二位数字表示生产者（1–3），从而得到风干牛肉干样本JB1–1、JB1–2、JB1–3、JB2–1、JB2–2、JB2–3和相应的风干羊肉干样本JM1–1、JM1–2、JM1–3、JM2–1、JM2–2、JM2–3。
所有采样程序均在无菌条件下进行。每个产品的外表面被修剪以去除潜在污染，然后切除约50克内部组织，转移到无菌采样袋中，立即在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C直至分析。
2.2 微生物群落分析
使用Mag-Bind Soil DNA Kit（Omega Bio-tek, Inc., Norcross, GA, USA）从均质化的肉样本中提取基因组DNA。根据制造商的协议，每个均质化样本使用约0.25克进行DNA提取。最初使用Nanodrop NC2000 UV–Vis光谱仪（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）定量DNA浓度，随后使用Qubit® 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）和Agilent Bioanalyzer 2100系统（Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA）进一步定量。通过1%琼脂糖凝胶电泳（Agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA；核酸标记DL15000, Takara, Kusatsu, Japan；TAE缓冲液（AM9870), Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）和DYY-6C电泳系统（Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China）评估DNA纯度和完整性，并使用BG-gdsAUTO（130）凝胶成像系统（Beijing Baygene Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China）进行可视化。提取过程中包括阴性对照和PCR空白对照，以监测潜在污染。
PCR扩增使用稀释的基因组DNA作为模板，引物针对16S rRNA基因的V3–V4区域（341F/806R）。每个30 μL反应液包含15 μL Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix（2×, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）、3 μL引物（2 μM）、10 μL基因组DNA（1 ng/μL）和2 μL无菌水。热循环条件为98°C 1分钟，随后是30个循环：98°C 10秒、50°C 30秒、72°C 30秒，最后在72°C延伸5分钟。PCR在Bio-Rad T100热循环仪（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）上进行。扩增子（400–450 bp）通过2%琼脂糖凝胶电泳（Agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA；核酸标记DL15000, Takara, Kusatsu, Japan；TAE缓冲液（AM9870), Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）进行验证，切除后使用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen, Hilden, Germany）纯化。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina, Inc., San Diego, CA, USA）构建文库，使用Qubit®进行定量，并在Illumina NovaSeq 6000平台（PE250）（Illumina, Inc., San Diego, CA, USA）上进行测序。原始读段根据条形码序列进行解复用并保存为FASTQ格式。首先使用cutadapt修剪接头和引物序列，然后使用FLASH v1.2.11合并配对末端读段。质量过滤、去噪、嵌合体去除和错误校正使用QIIME2版本2023.9中的DADA2算法进行。使用DADA2 v1.28.0算法（https://qiime2.org/）生成扩增子序列变异体（ASVs）。去除总丰度极低的序列（所有样本中总丰度<10），以减少潜在噪声。使用qiime2 classify-sklearn插件和预训练的朴素贝叶斯分类器（基于silva 138.1 ssuref nr99数据库，https://www.arb-silva.de/）进行分类注释，置信阈值为0.7。质量控制后，每个样本的测序深度为53,000至72,000个读段。根据稀释曲线分析，样本在下游多样性分析前被稀释至10,000个读段。计算α多样性指数（Chao1、观察到的ASVs、Shannon和Simpson），并生成稀释曲线。使用PCoA和UPGMA聚类基于Bray–Curtis距离进行分类组成分析，使用ANOSIM评估组间差异。使用Venn图显示共享和独特的ASVs。使用LEfSe v1.0（http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/）（Wang等人，2024a）识别差异性分类单元。通过质量控制过程中的阴性对照样本评估潜在污染物序列，未检测到主导污染物分类单元。
2.3 非靶向代谢组学分析
风味相关代谢物通过溶剂提取后进行甲氧基化和硅基化衍生化，再结合气相色谱-质谱（GC–MS）进行分析。将约50 ± 1 mg的均质化肉转移到2 mL微量离心管中，加入500 μL预冷却的提取溶剂（甲醇/氯仿，3:1，v/v），其中含有阿多醇（≥99%，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）作为内标。使用甲醇（HPLC级，CNW Technologies GmbH, Düsseldorf, Germany）和氯仿（HPLC级，Adamas Reagent Co., Ltd., Shanghai, China）作为提取溶剂。样品涡旋30秒，然后使用JXFSTPRP-24组织研磨机（Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., Shanghai, China）以40 Hz研磨4分钟。随后在冰水浴中使用YM-080S超声波清洗器（深圳方高微电子有限公司，中国深圳）进行5分钟的超声波提取。为了确保有效提取代谢物，均质化和超声波提取步骤重复了三次。提取物在4°C下使用Heraeus Fresco17离心机（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）以12,000 rpm（13,800 × g）离心15分钟。随后，将200 μL的上清液转移到新的试管中，并使用真空浓缩器（LNG-T98，中国太仓华美生化仪器厂）蒸发至干燥。为了质量控制，从每个提取物中取100 μL的样本混合，生成一个复合QC样本。通过加入60 μL的甲氧胺盐酸盐溶液（20 mg/mL溶于吡啶）并在80°C下孵育30分钟来进行衍生化。甲氧胺盐酸盐（AR级，TCI Chemicals（东京）有限公司，日本东京）和吡啶（HPLC级，Adamas Reagent Co., Ltd.，中国上海）用于甲氧基化反应。接着，加入80 μL的BSTFA试剂（含有1%的TMCS，v/v，REGIS Technologies, Inc.，美国伊利诺伊州莫顿格罗夫），并在70°C下孵育1.5小时进行硅基化。冷却后，向QC样本中加入5 μL的脂肪酸甲酯（FAME）混合物（Dr. Ehrenstorfer GmbH，德国奥格斯堡），用于保留指数校准。使用GC-2030气相色谱仪与QP2020 NX质谱仪（Shimadzu Corporation，日本京都）进行GC–MS分析，配备DB-5MS毛细管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm，Agilent Technologies, Inc.，美国加州圣克拉拉）。以不分流模式注入1 μL的衍生化样本，注射器温度设置为280°C。使用氦气作为载气，流速为1 mL/min，隔膜吹扫流速为3 mL/min。烤箱温度程序为50°C持续1分钟，然后以8°C/min的速度升高至310°C，并保持11.5分钟。传输线和离子源温度分别为280°C和200°C。电子电离在70 eV下进行，光谱以全扫描模式（m/z 50–500）以12.5 spectra s−1的速度采集，溶剂延迟时间为7.2分钟。选定的样本进行技术重复分析以评估分析重复性。定期（大约每4-5个样本）以及在分析序列开始和结束时注入混合QC样本，以监测仪器稳定性。在QC样本中显示RSD > 30%或检测到的样本比例低于50%的样本在统计分析前被剔除。还分析了空白样本以评估潜在的携带效应（Dunn等人，2011年）。原始数据使用ChromaTOF软件（版本4.3×，LECO Corporation，美国密歇根州圣约瑟夫）进行处理，包括峰提取、基线校正、反卷积、对齐和积分（Kind等人，2009年）。通过将质谱和保留指数与LECO-Fiehn Rtx5数据库匹配来进行代谢物注释，保留指数是使用C8–C30 FAME标准系列计算的。剩余的缺失值使用最小检测值的一半进行插补，并在多变量统计分析前将数据集归一化并对数转换。随后使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）筛选组间的差异代谢物，VIP > 1且p < 0.05的化合物被认为是统计学上显著的。为了控制多重检验，使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）方法进一步调整p值以获得Q值。2.4. 分析主要细菌属与核心代谢物之间相关性的方法根据第2.2节描述的LEfSe分析识别关键细菌属，并根据第2.3节描述的GC–MS结果和筛选标准（VIP > 1，p < 0.05）选择核心风味代谢物。由于微生物相对丰度数据是组成性的，在相关性分析之前应用了中心化对数比率（CLR）转换。使用Shapiro–Wilk检验评估变量的正态性。因为大多数变量不符合正态分布，使用Spearman等级相关系数来评估细菌属与代谢物之间的关联。使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）方法调整p值，FDR调整后的p < 0.05被认为是统计学上显著的。使用Wekemo Bioincloud的相关性模块（版本2024；Gao等人，2024年）进行相关性分析和热图可视化。在每个组内（空气干燥牛肉干或空气干燥羊肉干）分别计算相关性，使用家庭平均水平以保持与配对采样设计的一致性。2.5. 数据的统计分析实验数据使用Microsoft Excel、SPSS 27和Origin 2018进行处理。图表使用Origin 2018生成。Microsoft Excel用于数据组织和16S rRNA基因测序及衍生化风味代谢组学数据集的预处理，包括数据筛选、归一化和计算家庭平均水平。生产家庭被视为统计分析的生物重复。对于代谢组学数据，在统计测试之前对每个家庭内的两个批次的数据进行平均。SPSS 27用于推断统计分析。鉴于配对采样设计，使用配对样本t检验比较空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干的家庭平均水平，生产家庭被视为配对因素。空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干之间的差异在P < 0.05时被认为是统计学上显著的。所有结果以平均值±标准误差（SE）表示，计算来自独立的生产家庭。3. 结果与讨论3.1. 空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干中的细菌群落组成通过Illumina NovaSeq 6000平台（配对末端250 bp，PE250）对六个空气干燥肉样进行高通量测序，生成了646,829个经过质量过滤的序列（平均：每个样本107,804 ± 5943个序列；读取长度：227 bp）。使用基于DADA2算法的QIIME2生成扩增子序列变异体（ASVs），在达到最小测序深度后共获得12,588个ASVs。图S1展示了样本间细菌群落的Alpha多样性分析。观察到的ASVs曲线在低测序深度时显示出明显的波动，随着测序深度的增加逐渐稳定。尽管观察到的ASVs随着测序深度的增加而继续增加，表明仍在检测到稀有分类单元，但Shannon多样性曲线在大约10,000个读取时达到平台期，表明进一步的测序深度主要改善了丰度估计，而不是揭示额外的新分类单元。因此，选择10,000个读取作为稀释深度，因为这个阈值在保留所有样本用于下游比较分析的同时提供了稳定的多样性估计。所有样本的Goodscoverage值超过0.996，表明测序完整性高。这种测序覆盖率被认为足以进行关注主要和中等丰富度分类单元的比较生态分析，而不会显著影响生态解释。Alpha多样性作为评估微生物丰富度和多样性的关键指标。如表S1所示，JB组的Goodscoverage值超过0.9965，确认了足够的测序深度以准确表示微生物群落。JB组的Observed Species、ACE和Chao1指数高于JM组，尽管没有统计学意义（P > 0.05），表明物种丰富度相当。同样，JB组的Shannon和Simpson指数也略有升高（P > 0.05），表明物种均匀性和多样性相当。总之，虽然JB组的丰富度和多样性指标略优，但这些差异没有统计学意义。JB组和JM组之间的alpha多样性指数没有显著差异（P > 0.05）。这些指标描述了两种产品的整体群落多样性。在门水平上（图2A），Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota和Actinobacteriota共同占空气干燥牛肉干（JB）总微生物群落的97.32 ± 0.28%。同样，在空气干燥羊肉干（JM）中，Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteriota和Verrucomicrobiota共同占微生物群落的98.03 ± 0.12%。在这两种产品中，Firmicutes和Proteobacteria是主要的门。这些结果与Wang等人（2021e）的综述大体一致，他们报告Firmicutes和Proteobacteria是干燥和发酵肉制品中常见的门。然而，与Wang等人（2021a）总结的样本不同，后者主要来自中国南部的腌制和火腿产品，本研究中的样本来自内蒙古锡林郭勒地区自然空气干燥的牛肉干和羊肉干，那里的气候条件和原材料有显著差异。因此，目前的发现与之前关于Firmicutes和Proteobacteria优势的观察结果一致，并为在北部干旱气候条件下生产的空气干燥肉类提供了额外数据。（见图1。）下载：下载高分辨率图像（491KB）下载：下载全尺寸图像图1. 整体实验流程图。在属水平上（图2B），Lactobacillus、Halomonas、Psychrobacter和Kocuria被确定为空气干燥牛肉干（JB）中前五个主要属，共占微生物群落的60.69 ± 0.11%。同样，这些属也是空气干燥羊肉干（JM）中最丰富的五个属，占微生物群落的59.61 ± 0.08%。在两种产品中，Lactobacillus是最丰富的属，在JB中的相对丰度为19.18 ± 0.03%，在JM中为19.36 ± 0.03%。这些观察结果与之前的宏基因组证据一致（Wang等人，2021c；Svetlana等人，2023），这些证据表明Lactobacillus在发酵肉生态系统中的生态优势。这种优势通常归因于发酵肉系统中报告的生态特性，如耐酸性和竞争持久性，尽管这些特性在当前研究中没有通过实验验证。下载：下载高分辨率图像（220KB）下载：下载全尺寸图像图2. 条形图显示了干燥牛肉和干燥羊肉中的细菌群落组成。（A-D）条形图显示了门和属水平的物种相对丰度。样本特异性分析（图2C-D）显示所有样本在门水平上的保守性，Firmicutes（0.41–0.44）和Proteobacteria（0.36–0.39）表现出狭窄的丰度范围，表明在采样家庭间的相对稳定表示。家庭间的种间比较显示JM样本的Firmicutes相对丰度大约高21.7%，Actinobacteriota相对丰度低34.2%（P < 0.05，Welch's t检验，带BH校正）。尽管具有统计学意义，但由于独立家庭数量有限（n = 3），这些差异应谨慎解释。值得注意的是，JM1–3的Verrucomicrobiota丰度相对较高（6.8 ± 0.4%）。因为统计推断是在家庭水平上进行的（n = 3），这一观察代表样本水平的变化，而不是普遍的种间差异，这可能与原材料特性和加工相关的变异性有关，例如水分分布或盐分扩散，这些因素可能影响空气干燥过程中的微生物生长。在自发的发酵肉制品中通常观察到类似的样本依赖性变化（Barbier等人，2021）。这些观察结果与Zuo等人（2023）的宏基因组调查一致，他们确定Proteobacteria和Firmicutes是发酵肉基质中的普遍核心门。然而，当前结果仅描述了组成模式，没有直接评估功能能力。JM组的Kocuria相对丰度比JB组降低了39.4%（P < 0.05，Welch's t检验，带BH校正）。这种差异可能反映了与底物相关的微生物选择，而不是环境效应。鉴于空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干来自同一生产地点并在相同的空气干燥条件下处理，大规模的环境变化不太可能解释这种差异。相反，JM中Kocuria的减少更可能由与牛肉和羊肉之间原材料组成的内在差异相关的底物驱动的微生物选择解释，包括蛋白质结构、胶原蛋白相对水平和脂质谱型。这些组成差异可能改变了微生物群落中的营养可用性和种间竞争，从而限制了Kocuria在羊基质中的生态位，同时有利于其他属，如Ruminococcus和Serratia，这些属在JM样本中同时富集。在当前数据集中，这种模式支持了与底物相关的解释，尽管需要在更大规模和更受控的研究中加以确认。相比之下，Serratia和Ruminococcus在JM中富集，相对丰度大约是JB的1.1倍（P < 0.05，Welch's t检验，带Benjamini–Hochberg（BH）校正），表明与底物相关的组成变化。在属水平上，Lactobacillus在所有样本中仍然是最丰富的分类单元（相对丰度：0.17–0.21），其次是Halomonas（0.13–0.16）和Psychrobacter（0.13–0.15）。这一发现与之前的研究一致，这些研究显示乳酸菌在发酵肉系统中稳定了微生物生态系统并增强了风味特征（Cheng等人，2024）。与组水平趋势一致，JM样本的Kocuria丰度降低了39.4%（P < 0.05，Welch's t检验，带BH校正），同时Serratia/Ruminococcus相对丰度上调了1.08−/1.12倍（P < 0.05，Welch's t检验，带BH校正）。值得注意的是，JM1–3样本对Rikenella的抑制作用非常显著（0.02±0.01%对比其他样本的0.15–0.23%，P<0.05），这表明可能存在局部微环境限制——这些限制可能受到营养竞争或代谢物积累的影响，尽管这些机制并未直接评估。JB/JM系统之间的系统发育可塑性表明，原材料组成可能会影响空气干燥发酵过程中的微生物演替，但由于样本量有限，因此在更广泛的生态学意义上进行推广时应谨慎。3.2. 比较空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干中的细菌群落及差异属：为了进一步评估空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干样本之间整体群落结构的差异，基于细菌组成数据生成的Bray–Curtis距离矩阵进行了主坐标分析（PCoA）。PCoA结果（图3A）显示牛（JB）和羊（JM）样本之间没有显著的分离趋势，这与ANOISM结果一致（R=0，P=0.6）。前两个主坐标解释了总变异的53.12%（PC1：27.75%，PC2：25.37%）。JB样本主要分布在第一象限，而JM样本主要位于第四象限，两组之间存在部分重叠。例如，JB1–2靠近JM样本，而JM1–3则显示出相对独立的分布模式。下载：下载高分辨率图像（279KB）下载：下载全尺寸图像图3. 干燥牛肉和干燥羊肉的微生物群落比较。（A）主坐标分析（PCoA）图。（基于中心化对数比率变换后的ASV相对丰度Bray–Curtis距离，显示样本群落的差异。）（B）UPGMA聚类树。（根据Bray–Curtis距离计算群落相似性。）（C）ANOISM分析箱线图（用于测试群落差异的统计显著性（R值和p值）。（D）维恩图。（显示不同组之间共享和独特的ASV数量。）（E）LEfSe分析图。（根据LEfSe分析显示干燥牛肉和干燥羊肉之间具有差异效应大小的细菌属（LDA阈值>3.0））。基于Bray–Curtis距离的层次聚类分析（图3B）显示JM1–1和JM1–2紧密聚集，JB1–2也位于附近。JB1–1和JB1–3形成了另一个簇，而JM1–3则表现为一个相对独立的分支，表明样本之间存在一定的组成差异。然而，ANOISM结果（图3C）表明组内和组间差异不显著（R=0，P=0.6），表明组内和组间变异水平相当。总体而言，排序和聚类分析表明，尽管观察到了一些小的分布模式，但在整体细菌群落结构方面，空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干之间没有明显的组别差异。比较维恩分析（图3D）确定了牛（JB）和羊（JM）系统之间有354个共享属，其中123个为JB特有的，102个为JM特有的，表明JB的独特性略高。观察到与基质相关的差异：JB群落中包含未培养的Bacteroidales（28%）、Dactylosporangium（28%）和SWB02（17%），而JM生态系统中则偏好Shuttleworthia（26%）、Arthrobacter（25%）和未培养的Clostridiales（21%）。核心微生物组分析突出了Lactobacillus（19%）、Halomonas（15%）和Psychrobacter（15%）作为两种基质上的通用功能枢纽。与Coton等人（2024年）报告的法国商业干式熟成牛肉中的发现相比，后者以Pseudomonas spp.为主导，Lactobacillus仅占约2%，当前样本中Lactobacillus的相对丰度明显更高，这可能反映了气候条件和加工方法的差异。差异丰度分析（图3E）表明，不同组之间有几个属的丰度模式存在显著差异，包括JM中Ruminococcus、Leuconostoc和Marinilactibacillus的相对丰度较高，而JB中Kocuria、CHKCI002和Escherichia/Shigella的丰度较高。差异丰度分析使用了LEfSe和STAMP（Welch's t检验，采用Benjamini–Hochberg校正）进行，如第2节所述。然而，考虑到样本量较小（每组n=3）以及16S rRNA测序数据的组成特性，这些方法的统计功效可能有限，不能排除假阳性的风险。因此，所报告的差异属应被视为潜在基质相关趋势的探索性指标，而不是具有统计确定性的生物标志物。这些观察结果与全球发酵肉类的研究一致——与Lactobacillus在熟成牛肉中的主导地位（Zheng等人，2023年）相符，但与无辐照切碎牛肉中Enterobacter（25.94%）和Staphylococcus（17.28%）的主导地位不同（Xu等人，2024年）。值得注意的是，JM中Serratia和Colidextribacter的富集与藏牦牛干中Pseudomonas/Arcobacter的流行（Zhang等人，2024a）以及羊肉香肠中Haemophilus的主导地位（Niu等人，2024年）形成鲜明对比，共同表明微生物群落受到基质生化、地理气候参数、加工工艺和文化传统的深刻影响。观察到的种间差异——特别是JM中Ruminococcus的相对较高丰度和Kocuria的比例较低——可能与基质特定的营养成分有关，包括牛肉和羊肉之间的蛋白质结构、胶原蛋白含量和脂质谱的差异（Glover等人，2022年）。本研究还检测到了胶原酶（EC 3.4.24.3），表明微生物可能参与了胶原蛋白的降解。这些与基质相关的代谢差异可能会影响空气干燥过程中的微生物演替。总体而言，这些发现表明原材料特性可能影响传统空气干燥肉类的微生物群落结构。3.3. 空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干中非靶向代谢物的比较分析对十二个空气干燥肉样进行了全面的GC–MS分析。经过峰值解卷积和注释后，获得了838个代谢特征。在空气干燥牛肉干（JB）中，共鉴定出309种挥发性有机化合物（VOCs），并将其分类为11个化学类别（图4A）。其中，有机酸及其衍生物占主导地位（24.92%，77种化合物），其次是脂质和类脂分子（20.39%，63种化合物）、其他代谢物（19.09%，59种化合物）、含氧有机化合物（17.48%，54种化合物）、有机杂环化合物（7.44%，23种化合物）、苯类化合物（3.88%，12种化合物）以及核苷/核苷酸及其类似物（3.88%，12种化合物）。在空气干燥羊肉干（JM）中，鉴定出269种挥发性有机化合物，并同样将其分类为11个化学类别（图4B）。有机酸及其衍生物也是最大的一组（26.02%，70种化合物），其次是脂质和类脂分子（21.93%，59种化合物）、其他代谢物（19.33%，52种化合物）、含氧有机化合物（15.61%，42种化合物）、有机杂环化合物（5.95%，16种化合物）、苯类化合物（4.09%，11种化合物）以及核苷/核苷酸及其类似物（4.09%，11种化合物）。在空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干中观察到的有机酸及其衍生物和脂质及类脂分子的相对较高比例可能与空气干燥过程中的微生物代谢和脂质氧化降解有关；然而，鉴于生物重复性有限（每组n=3），这些解释应视为初步的，并需谨慎解读。下载：下载高分辨率图像（399KB）下载：下载全尺寸图像图4. 干燥牛肉和干燥羊肉的挥发性风味代谢物谱（相对丰度）。（A-B）风味物质分类的圆形图。（显示GC–MS检测到的不同类别中的挥发性及半挥发性风味化合物的相对比例）。（CD）风味代谢物雷达图。（该图显示了干燥牛肉和干燥羊肉样本中主要代谢物的分布，反映了它们的风味特征。从质量控制数据集中选择了基于相对高丰度和在发酵或空气干燥肉制品中报告的感觉相关性的代表性挥发性化合物。）具体来说，有机酸的积累可能反映了碳水化合物的微生物发酵，而脂质和类脂分子可能与脂质水解和氧化反应有关（Li等人，2025年）。总体而言，这些化合物可能参与了空气干燥肉类的风味形成，它们相对水平的差异可能部分解释了空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干之间不同的风味特征，尽管需要更广泛的验证。先前使用HS-SPME-GC–MS方法分析新鲜牛肉或原始肌肉组织中的挥发性化合物的研究通常会鉴定出数十种VOCs，其中脂质衍生的挥发物经常被报告为主要成分（Sun等人，2022a；Bhadury等人，2021年）。这些研究为肉类基质中的挥发性物质检测提供了总体参考。然而，本研究关注的是自然空气干燥的肉制品，并不打算直接比较新鲜肉和空气干燥肉之间的挥发性复杂性。如图4C–D所示，空气干燥牛肉干（JB）中的主要代谢物包括2-脱氧-D-阿拉伯糖醇、亮氨酸、氧脯氨酸、次黄嘌呤1、缬氨酸、D-塔洛糖1、异亮氨酸、果糖1、琥珀酸和果糖2。这些化合物包括有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、含氧有机化合物以及核苷/核苷酸及其类似物。这些代谢物代表了主要检测到的成分，可能与空气干燥牛肉干的风味发展和质量属性有关。功能上，这些代谢物既作为关键的风味前体，也直接贡献于感官特性。支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）的含量相对较高，表明在空气干燥过程中发生了显著的蛋白质降解。这一观察结果表明加工过程中发生了活跃的蛋白质水解，尽管需要在更大的样本集中进行定量验证以确认这一趋势。这些化合物不仅影响味觉感知，还作为挥发性风味化合物的关键前体，包括支链醛、醇和酸，这与JB中脂质和含氧挥发性物质的富集模式相符（Chen等人，2024年）。像果糖和2-脱氧-D-阿拉伯糖醇这样的糖类为非酶促褐变反应提供了底物。尽管这些化合物本身的挥发性较低，但它们可以通过Maillard反应和氧化反应在空气干燥及后续加工过程中间接参与产生甜味和烘焙香气（Liu等人，2022a）。然而，它们在本研究中的具体贡献是基于代谢谱推断的，而非直接感官验证。琥珀酸可能来源于微生物代谢和三羧酸循环，其适度积累可能有助于风味层次的形成，并与氨基酸衍生物化合物协同作用，建立空气干燥牛肉干的基础风味谱。次黄嘌呤的富集反映了核苷酸的逐步降解，这可能是成熟度和鲜味的指标，尽管需要进一步的针对性量化。在空气干燥羊肉干（JM）中，相对高水平的代谢物包括氧脯氨酸、2-脱氧-D-阿拉伯糖醇、硬脂酸、牛磺酸、琥珀酸、肌苷、次黄嘌呤1、亮氨酸、雌二醇和缬氨酸。这些化合物涵盖了有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、含氧有机化合物、核苷/核苷酸及其类似物以及其他代谢物，可能与空气干燥羊肉干的风味形成和质量演变有关。功能上，这些代谢物既作为重要的风味前体，也直接贡献于感官特性。支链氨基酸（亮氨酸和缬氨酸）的含量相对较高，表明在空气干燥过程中发生了显著的蛋白质降解。这些化合物不仅影响味觉感知，还作为挥发性风味化合物的关键前体，包括支链醛、醇和酸，这与JB中的脂质和含氧挥发性物质的富集模式相符（Chen等人，2024年）。像果糖和2-脱氧-D-阿拉伯糖醇这样的糖类为非酶促褐变反应提供了底物。尽管这些化合物本身的挥发性较低，但它们可以通过Maillard反应和氧化反应在空气干燥及后续加工过程中间接参与产生甜味和烘焙香气（Liu等人，2022a）。尽管如此，它们在本研究中的具体贡献是基于代谢谱推断的，而非直接感官验证。琥珀酸可能来源于微生物代谢和三羧酸循环，其适度积累可能有助于风味层次的形成，并与氨基酸衍生物化合物协同作用，建立空气干燥牛肉干的基础风味谱。次黄嘌呤的富集反映了核苷酸的逐步降解，这可能是成熟度和鲜味发展的指标，尽管需要进一步的针对性量化。在空气干燥羊肉干（JM）中，相对高水平的代谢物包括氧脯氨酸、2-脱氧-D-阿拉伯糖醇、硬脂酸、牛磺酸、肌苷、次黄嘌呤1、亮氨酸、雌二醇和缬氨酸。这些化合物涵盖了有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、含氧有机化合物、核苷/核苷酸及其类似物以及其他代谢物，可能与空气干燥羊肉干的风味形成和质量演变有关。功能上，这些代谢物既作为重要的风味前体，也直接贡献于感官特性。支链氨基酸（亮氨酸和缬氨酸）的作用与JB中的类似，可能与JM中的脂质和类脂分子谱协同作用，产生空气干燥羊肉干的特色肉香和成熟风味。像2-脱氧-D-阿拉伯糖醇这样的糖醇和像琥珀酸这样的有机酸同样有助于基本风味框架的形成，与它们在空气干燥牛肉干中的作用相似。此外，肌苷和次黄嘌呤的积累反映了深度的核苷酸降解，这可能与羊肉成熟过程中的鲜味形成和质量演变有关。脂肪酸如硬脂酸为脂质氧化提供了底物基础，可能有助于空气干燥羊肉干的特征风味的发展。3.4. 空气干燥牛肉干和空气干燥羊肉干中非靶向代谢物的比较分析主成分分析（PCA）显示牛（JB）和羊（JM）样本之间存在明显的聚类，PC1（48.1%）和PC2（10.9%）共同解释了59%的总变异（图5A）。组内聚类和组间分离表明物种间的代谢组学差异。正交投影到潜在结构判别分析（OPLS-DA）通过结合先验类别信息增强了组间区分，产生了预测成分（47.3%）和正交成分（8.86%）的变异（图5B）。生物重复物的紧密聚类和明显的组间分离表明了显著的代谢组学差异（P<0.01，排列测试）。需要注意的是，区分性能是基于家庭水平数据（每组n=3）评估的，因此由于生物重复性有限，模型的稳定性应谨慎解释，这可能限制了模型的普遍性。OPLS-DA分析显示JB和JM样本之间有明显的分离，但需要更大样本量的进一步研究来确认。如图5C-D所示，OPLS-DA模型表现出优异的拟合度（R2Y=0.999）和强大的预测能力（Q2=0.972），均超过了0.9的阈值，表明模型参数稳健且合理。然而，尽管有这些有利的统计指标，但由于样本量较小，仍需谨慎解释模型的稳健性。200倍外部交叉验证的排列测试得到的截距分别为R2=0.81和Q2=-0.98。尽管R2截距相对较高（0.81），但负的Q2截距（-0.98）和陡峭的回归斜率共同表明没有过拟合现象。然而，使用更大的样本集进行独立验证将增强对这些发现的信心。下载：下载高分辨率图像（398KB）下载：下载全尺寸图像
图5. 干牛肉和干羊肉中风味相关代谢物差异的分析图（相对丰度）。(A) 主成分分析（PCA）图。（基于GC–MS数据，显示样品间风味代谢物的相对峰面积差异。)(B) OPLS-DA图。（用于识别组间主要差异代谢物。)(C) OPLS-DA排列测试图。（用于评估模型的稳健性。)(D) 累积R2Y和Q2相关性图。（反映OPLS-DA模型的解释能力和预测能力。)(E) 文氏图。（显示每组核心差异的交集和独特代谢物。)(F) 火山图。（显示两组间代谢物的显著差异（VIP > 1，p < 0.05）。)(G) 杆状图。（显示代谢物的分类和组间丰度差异。)(H) 雷达图。（显示两组样品中具有感官意义的主要风味代谢物的分布。)
为了进一步阐明挥发性成分的物种依赖性差异，进行了差异代谢物分析。文氏图分析（图5E）显示，空气干燥的牛肉干（JB）和空气干燥的羊肉干（JM）系统中共有254种挥发性风味化合物。此外，有55种化合物是空气干燥的牛肉干特有的，而15种是空气干燥的羊肉干特有的，这可能表明在当前分析条件下空气干燥的牛肉干检测到的化学多样性相对较高；然而，鉴于样本量有限，这一观察结果应谨慎解释。空气干燥的牛肉干特有的代谢物大致可以分为氨基酸及其衍生物、脂肪酸和脂质衍生物、吲哚化合物和色氨酸相关代谢物、碳水化合物和有机酸衍生物以及核苷和嘌呤相关代谢物。其中，5-氨基戊酸内酰胺是一种与赖氨酸代谢相关的氨基酸衍生物，常见于空气干燥的肉制品中。其在空气干燥的牛肉干中相对较高的丰度可能反映了在低湿度和长时间干燥条件下的蛋白质降解过程。先前的研究表明，这类化合物与发酵肉制品特有的肉香和成熟香气密切相关，是风味发展的关键代谢标志物（Zhang等人，2021年）。尽管如此，在本研究中，其功能贡献是从代谢组学模式推断出来的，而不是通过直接感官验证得出的。
在吲哚和色氨酸相关代谢物类别中，色氨酸醇来源于色氨酸代谢，是发酵食品中常见的芳香代谢物。它可能有助于增加空气干燥产品的风味复杂性和持久性，尽管这需要进一步确认（Alessandro等人，2019年）。脂肪酸和脂质衍生物，如棕榈酸，在牛肉中含量丰富。在干燥过程中，水分的减少促进了这些脂质的轻微氧化反应，可能促进了与脂肪香气相关的化合物的形成，并影响了风味的持久性和平衡（Domínguez等人，2019年）。
空气干燥的羊肉干特有的代谢物被分为氨基酸及其衍生物、芳香有机酸及其衍生物、脂肪酸和类固醇相关代谢物、碳水化合物和糖苷以及核苷。在检测到的代谢物中，有几种在JM中的丰度相对较高（VIP > 1，P < 0.05），包括植酸，这种化合物在反刍动物产品中已有报道，并可能参与干燥过程中的脂质转化。研究表明，植酸及相关代谢物有助于形成羊肉特有的脂肪香气和物种特异性气味，是区分空气干燥的羊肉干与其他肉制品的重要化学基础（Zhang等人，2024b年）。在本研究中，这些关联应被视为指示性的而非决定性的，因为生物重复性有限。芳香有机酸如3-苯乳酸据报道能提供微妙的芳香效果，并适度减少不良异味，从而改善整体风味和谐性（Sun等人，2025年）。
氨基酸衍生物腐胺与风味深度和余味的发展有关，可能与空气干燥的羊肉干的成熟风味特征有关。两种肉制品共有的代谢物主要分为氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、脂肪酸和脂质相关化合物、碳水化合物和糖酸衍生物以及核苷/嘌呤/嘧啶相关代谢物。乳酸是一种典型的糖酵解产物，在牛肉和羊肉中都存在，它在调节酸度和影响蛋白质结构及微生物代谢方面起着双重作用，从而影响整体风味的平衡和稳定性（Wang等人，2024a年）。然而，在当前样本中，其精确的贡献并未在感官层面直接量化。支链氨基酸亮氨酸是一种常见的风味前体，会进一步转化为支链醛、醇和酸，有助于形成挥发性风味化合物（Chen等人，2024年）。长链醇植醇来源于脂质相关结构或其降解产物，被认为可以增强脂肪香气背景，可能改善风味的圆润度和持久性（Carmen等人，2022年）。
比较代谢组学分析确定了牛（JB）和羊（JM）样本之间的838种共有代谢物，其中404种在相对水平上存在显著差异（VIP > 1，P < 0.05）（图5F）。跨越11个化学类别的差异代谢物包括260种在JB中相对含量较高的化合物（例如L-甲硫氨酸、D-葡萄糖胺-1-磷酸和果糖-6-磷酸；差异为1.8至3.2倍），这些化合物与蛋白质生物合成和糖酵解途径功能相关。相反，144种在JB中相对含量较低的代谢物（相对水平低0.3至0.6倍），包括植酸、柠檬酸和牛磺酸，与β-氧化途径和线粒体能量代谢有很强的关联（图5G）。这些途径关联基于数据库注释，应被视为假设的功能意义。与其他肉类类型的代谢组学研究相比，后者通常报告检测到的代谢物较少，且差异化合物主要集中在中心碳和氨基酸代谢上（Sun等人，2022a；Fu等人，2022；Anwar等人，2025），我们的数据集（838种共有代谢物；404种显著差异，VIP > 1，P < 0.05）揭示了涵盖糖酵解/蛋白质生物合成（例如果糖-6-磷酸、L-甲硫氨酸）和β-氧化/线粒体相关途径（例如柠檬酸、牛磺酸）的相对广泛的代谢物谱。这种扩展的覆盖范围可能反映了内蒙古Xilingol地区牛和羊自然风干过程中的代谢多样性。然而，不同研究之间的分析平台、样本制备策略和注释流程的差异也可能影响代谢物数量和途径分布。因此，虽然我们的发现与之前强调氨基酸和脂质为中心的差异的研究结果大体一致，但跨研究比较应谨慎解释，特别是考虑到本研究中生物重复性有限。
L-甲硫氨酸（在JB中上调2.7倍）是一种必需的含硫氨基酸，已知参与硫代谢和氧化还原调节，其相对丰度可能影响肉基质内的氧化反应。值得注意的是，其在发酵肉基质中的氧化敏感性通过二硫键形成和表面疏水性改变来调节蛋白质功能（Li等人，2024年）。牛磺酸（下调0.4倍）是一种磺酸衍生物，通过调节胆固醇和清除ROS表现出心脏保护作用，特别是保护神经完整性免受氧化损伤（Aydın等人，2016年）。虽然这些生理功能已有充分记录，但它们与当前系统中的风味形成直接相关性仍有待探讨。
总体而言，观察到的模式与之前强调发酵肉中氨基酸和脂质相关差异的报告大体一致；然而，需要通过更大规模的队列进行验证（Liu等人，2023b；Li等人，2023）。值得注意的是，Wang等人鉴定出的1782种风味相关代谢物（包括23.1%的脂质和18.7%的有机酸）在手工制作的肉干产品中得到了证实（Wang等人，2024c）。跨研究的有机酸衍生物的反复检测支持它们在pH调节和成熟过程中的潜在作用，尽管定量可比性有限。
基于内标标准化的非靶向代谢组学分析显示，牛（JB）和羊（JM）产品之间存在显著的组成差异，JM中的D-塔洛糖相对水平高出4.7倍（P < 0.001），同时异亮氨酸（3.2倍）、甘氨酸异构体（2.8–3.1倍）和脯氨酸（2.5倍）的相对水平也显著增加（图5H）。肉豆蔻酸（0.4倍）和肉碱（0.3倍）的相对水平同时下降，表明可能存在与底物相关的脂质重塑，而氨基酸流量的增加与之前报道的发酵相关的支链氨基酸富集一致；然而，鉴于样本量有限（每组家庭水平为3个样本），这些趋势应被视为初步观察结果，而非确定的物种特异性特征。
3.5. 主要菌属与核心代谢物之间的相关性分析
相关性分析表明，在空气干燥的牛肉干（JB）和空气干燥的羊肉干（JM）中，主要细菌属与相对含量较高的代谢物之间存在几种统计学上支持的关联模式（图6A–B）。相关性系数是在每种肉类型内的家庭水平上计算的（每种肉类型3个独立家庭），使用CLR转换后的相对丰度数据和Spearman等级检验以及Benjamini–Hochberg FDR校正，如第2.4节所述。鉴于生物重复性有限，只有经过FDR调整后仍显著的相关性被解释，这些关联应被视为探索性的。分别对牛肉和羊肉组（每组3个家庭）使用每个家庭的平均值计算相关性。在空气干燥的牛肉干（JB）中，乳酸菌与异亮氨酸表现出显著的正相关。这种关联与乳酸菌在发酵肉系统中的蛋白分解能力一致，其中蛋白质分解可能有助于释放异亮氨酸等氨基酸（Liu等人，2021年）。然而，鉴于本分析基于相关性，这种关系应被视为统计关联而非直接的功能确认。Halomonas与2-脱氧赤藓糖醇和琥珀酸表现出显著的正相关。其中，2-脱氧赤藓糖醇有助于维持细胞渗透压平衡，这与Halomonas的耐盐特性密切相关，而琥珀酸增强了鲜味属性。这些功能解释来自文献报道，不应被视为当前系统中代谢因果关系的直接证据。同时，Halomonas与羟脯氨酸、果糖1和果糖2显著负相关，表明该属可能在空气干燥的牛肉干加工过程中优先利用果糖作为能量来源。
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图6. 相关性热图。(A) 显示牛肉中相对丰富的细菌属与相对高水平代谢物之间关联的相关性热图。(B) 显示羊肉中相对丰富的细菌属与相对高水平代谢物之间关联的相关性热图。
这些相互作用也可能间接影响其他微生物的活性，从而调节质地-风味平衡；然而，这仍然是推测性的。相比之下，Rikenella与羟脯氨酸、果糖1和果糖2表现出显著的正相关，表明该属可能通过分泌胶原酶参与胶原蛋白的降解，从而提高产品的嫩度。然而，本研究中并未直接测量酶活性，这种推断仅基于相关性模式。同时，其在果糖利用方面的相对较低效率导致果糖在系统中的积累。相反，Rikenella与2-脱氧赤藓糖醇和琥珀酸表现出显著的负相关，表明其代谢活性更倾向于蛋白质降解，而其碳水化合物发酵能力相对较弱。值得注意的是，Rikenella的相关模式与Halomonas和Lactobacillus相反，表明在空气干燥的牛肉干加工条件下这些属的关联趋势存在对比。此外，Kocuria、Psychrobacter、Clostridia_UCG-014和Serratia作为协同属，表现出类似的代谢互补模式。这些协调的相关模式可能反映了空气干燥的牛肉干所特有的高盐、低温和低水分活性环境中的共现模式，尽管无法建立因果关系。
在空气干燥的羊肉干（JM）中，乳酸菌在相关网络中显得相对中心，并与肌苷和2-羟基吡啶表现出显著的正相关，同时与雌三醇表现出显著的负相关。据报道，乳酸菌在发酵肉系统中具有核酸酶活性，可能有助于肌苷的形成。肌苷作为关键的风味前体，有助于增强产品的整体风味复杂性（Wang等人，2023年）。乳酸菌与2-羟基吡啶之间的正相关被认为与微生物代谢过程中嘧啶衍生物的形成有关。然而，这一假设基于代谢注释，需要进一步验证。相比之下，与雌三醇的负相关可能是由于前体化合物的消耗或间接的代谢相互作用所致。然而，目前的发现基于相关性分析，并未建立直接的代谢因果关系。作为一种耐寒菌属，Psychrobacter表现出与Lactobacillus完全一致的相关性模式。这种相似性可能表明在核酸相关的代谢过程中存在类似的关联结构，尽管直接的协同机制尚未通过实验得到验证。此外，Psychrobacter的耐寒适应性补充了Lactobacillus的代谢活性，使得在低温处理条件下能够实现稳定的代谢调节（Tian等人，2022年）。相比之下，Clostridia_UCG-014表现出与Lactobacillus相反的相关性趋势，表明这些微生物类群之间存在明显的代谢分工。可以推测Lactobacillus和Clostridia_UCG-014占据不同的代谢生态位；然而，本研究并未直接追踪底物流动情况。Halomonas与琥珀酸、硬脂酸和肉豆蔻酸显示出显著的正相关性。已知琥珀酸可以增强鲜味特性，而硬脂酸和肉豆蔻酸等脂肪酸的积累可能与Halomonas参与脂质代谢有关。这些关联表明它们与脂质相关代谢物存在统计上的共现，尽管脂质降解途径并未直接量化。Kocuria表现出与Halomonas高度一致的相关性模式，而Ruminococcus和Serratia则表现出完全相反的趋势。这些对比关系表明这四个属在脂质代谢、鲜味化合物形成和耐盐适应性方面具有功能互补性。总体而言，这些相关性网络可能反映了微生物与代谢物之间的协调相互作用，但需要进一步的机制确认。总体而言，Lactobacillus在相关性网络中处于中心位置，并与Halomonas、Kocuria和Psychrobacter等属共同形成了一个统计上相互关联的网络。鉴于数据集的探索性质（每组n=3），这个网络应被视为一个假设生成框架，而不是微生物调控层次的确定性证据。
在两种风干肉制品中，Lactobacillus主要表现出中等强度的相关性，表明其在风干肉系统中对核心代谢物的调控作用具有一定的保守性。然而，其在风干牛肉干和风干羊肉干中的具体关联模式有所不同。在风干牛肉干中，Lactobacillus与异亮氨酸显示出显著的正相关性，而在风干羊肉干中则未观察到这种关联。相反，在风干羊肉干中，Lactobacillus与肌苷和2-羟基吡啶显示出显著的正相关性，并与雌三醇显示出显著的负相关性。此外，在风干牛肉干中，Lactobacillus与多种代谢物显示出显著的负相关性。这些差异可能与原材料基质的变化有关，包括蛋白质和脂质组成及其相对比例的差异，以及加工过程中底物特异性代谢物的生成。尽管存在这些产品特异性差异，但在两种产品中都一致观察到多个细菌属之间的正负代谢互补模式。在风干牛肉干和风干羊肉干中，Halomonas和Kocuria主要表现为正相关属，而Rikenella、Clostridia_UCG-014、Serratia和Ruminococcus则表现为负相关属。同时，Lactobacillus和未培养的微生物作为中等相关性的补充类群。这种结构化的关联模式可能表明在风干条件下存在相对稳定的共现结构，尽管生态稳定性并未进行纵向评估。
值得注意的是，这些相互作用涉及的代谢物类别主要是氨基酸、有机酸和糖类衍生物，这些物质被广泛认为是风味形成的重要贡献者。先前也有报道指出微生物类群与代谢物之间存在类似的关联模式。例如，Yang等人通过对发酵肉制品进行整合宏基因组学和代谢组学分析，发现乳酸菌和球菌与氨基酸、脂肪酸和挥发性化合物显著相关，表明它们之间存在协同代谢作用。此外，Xing等人（2023年）强调肉制品中的微生物群落通过蛋白质、脂质和碳水化合物途径相互作用，优势属和次优势属之间的互补性有助于风味形成和品质稳定性。总体而言，目前基于相关性的发现与先前描述发酵肉中微生物-代谢物关联结构的报告大体一致。然而，由于生物重复性有限和观察性设计，这些结果应被视为支持风干肉系统中潜在微生物代谢相互作用的初步证据，需要通过扩大样本量和功能测定来进一步验证。
3.6. 讨论
风干牛肉干和风干羊肉干之间观察到的微生物组成和代谢物谱的差异可能反映了两种基质之间原材料组成和底物可用性的内在差异。牛肉和羊肉在蛋白质组成、脂质谱、脂肪酸分布和内源性酶活性方面的内在差异可能会影响微生物定殖和代谢过程，从而形成特定基质的微生物-代谢联系模式。在本研究中，优势属与代谢物之间的关联在风干牛肉干和风干羊肉干之间有所不同，表明存在底物依赖的相互作用网络，而不是普遍保守的代谢关系。先前对新疆传统发酵肉的研究报告指出Staphylococcus、Micrococcus和Lactobacillus物种具有功能优势，其中Lactobacillus通过双重代谢作用发挥作用：促进生物活性肽形成的蛋白水解活性以及生成乙酸、甲酸和琥珀酸等有机酸的碳水化合物代谢，这些有机酸是下游风味化合物的前体（Wang等人，2021d；Coral等人，2022年）。尽管在本研究中Lactobacillus也是风干牛肉干和风干羊肉干中的主要属，但属级别的关联在两种基质之间有所不同，表明微生物功能可能受到底物环境的影响。
尽管如此，在手工生产系统中比较风干牛肉干和风干羊肉干时，仍可能受到加工相关变异的影响。尽管在每个家庭内部实施了配对采样以减少生产者间的差异，但生产参数并未进行实验标准化。盐分渗透、切割几何形状、干燥微环境、气流条件和卫生处理等微妙因素的差异可能会影响微生物组装和代谢活性。因此，虽然配对的家庭级设计有助于控制生产者效应，但观察到的风干牛肉干和风干羊肉干之间的差异不应仅归因于在完全标准化处理条件下的动物种类。重要的是，风干牛肉干和风干羊肉干是在同一家庭中使用相似的传统工艺同时生产的，因此系统性的生产者特定偏差不太可能完全解释代谢组谱中观察到的差异。三个独立生产单元之间的可重复性差异表明，原材料组成可能在很大程度上（但不是唯一地）影响了观察到的微生物-代谢模式。因此，本研究中的动物种类应主要作为一个比较框架，而不是一个完全独立的生物学变量。
独立生产家庭的数量有限（每种肉类类型n=3），这限制了统计功效并限制了发现的广泛推广。因此，基于相关性的分析应被视为探索性和假设生成的，而不是确认性的。特别是，每个产品组内的相关性分析基于非常少的生物重复次数，这可能导致相关系数不稳定，即使经过CLR转换和FDR校正后也是如此。由于相关性分析是在每个产品组内单独进行的，因此所得到的关联应谨慎解释，并被视为需要在更大数据集中验证的初步观察结果。使用LEfSe分析识别出不同的分类特征，该方法结合了非参数统计测试和效应大小估计。然而，当生物重复性有限时，基于LEfSe的差异分类识别的稳健性可能会降低，检测到的区分属应被视为指示性的而非决定性的生物标志物。本研究中报告的α多样性指数仅用于描述整体微生物群落结构，并未用于推断风干牛肉干和风干羊肉干样本之间的功能差异或代谢能力。微生物-代谢物关联的分析独立于多样性指标进行，因此对微生物-代谢联系的解释并未基于α多样性比较。未测量与风味形成密切相关的几个物理化学参数，包括水分活度（Aw）、脂质氧化（TBARS）和蛋白质氧化。这些因素可能与微生物代谢相互作用并影响关键风味前体的形成，从而限制了对观察到的微生物-代谢关联的深入机制解释。此外，描述加工条件的详细定量元数据（如确切的盐浓度、干燥时间和微气候温度或湿度）并未通过仪器记录。
对于微生物群落分析，从每个家庭收集的两个生产批次在提取DNA之前进行了均质化，以获得每个生产单元的代表性微生物群落谱。虽然这种方法有助于减少紧密相邻的手工批次之间的随机变异并避免伪重复，但也限制了对同一家庭内短期时间变异性的评估。相比之下，代谢组学测量是在每个批次的独立样本上进行的，以保留潜在的样本级变异，然后在家庭层面对批次测量结果进行平均以进行统计比较。此外，测序过程中未包含模拟群落标准。尽管在DNA提取和扩增过程中应用了阴性对照，但缺乏明确的模拟群落限制了测序准确性的直接评估和潜在的方法学偏差。未来包含更大样本量、综合物理化学测量和时间分辨多组学分析的研究将有助于阐明风干肉生产过程中的微生物演替和代谢物转化途径。包括目标功能测定或模型发酵系统的控制验证实验将进一步帮助确定Kocuria和Ruminococcus等属对风味形成的具体贡献。这些方法将加强因果推断，并提供对传统风干肉系统中底物驱动的微生物组装和代谢输出的更全面理解。
4. 结论
本研究表明，尽管风干牛肉干和风干羊肉干共享几种主要的细菌属，但它们表现出不同的微生物和代谢物谱。在两种产品中，Lactobacillus约占社区的17-21%，Halomonas占13-16%，表明它们在所研究的风干条件下的优势地位。在属水平上，Kocuria在风干牛肉干中更为丰富，而Ruminococcus和Serratia在风干羊肉干中更为丰富。这些组成差异伴随着代谢物谱的变化，特别是在氨基酸、有机酸和脂质相关化合物方面，导致风干牛肉干和风干羊肉干样本在多变量分析中的分离。相关性分析进一步揭示了优势细菌属与选定代谢物之间的特定基质关联模式；然而，这些关系基于统计关联，并未建立代谢因果关系。所有统计分析都在一个配对的层次框架内进行，其中生产家庭被视为随机分组因素（每种肉类类型n=3）。鉴于生物重复性有限，这些发现应谨慎解释并保守推广。
