精准发酵实现食品蛋白成本效益的挑战与策略
随着全球人口增长，预计到205年蛋白质需求量将比目前高出80%，传统食品生产方式难以满足这一挑战。精准发酵（PF）作为一种有前景的替代方案已发展超过十年，但其大规模商业化仍受生产成本制约。实现成本效益的关键在于获得前所未有的高蛋白滴度，这需要高度优化的工业菌株和高效工艺。本文以Aspergillus oryzae（米曲霉）为平台，探讨了如何加速菌株优化，以实现乳蛋白（如β-乳球蛋白， BLG）等产品的商业化生产。
如何优化高度优化的工业米曲霉菌株
米曲霉作为工业细胞工厂已被优化数十年，用于生产多种食品和饲料蛋白。优化的工业菌株通常具有较低的蛋白酶水平（以提高产品稳定性）和较少的副活性（以增加蛋白纯度）。生产菌株的安全性也至关重要，最近描述的一个不产霉菌毒素和抗生素的米曲霉菌株系，为食品蛋白生产树立了安全标准。
为优化米曲霉中BLG的滴度，研究人员采用了多种策略的组合，包括理性菌株设计（RSD）、经典诱变（CM）以及适应性实验室进化（ALE）等。发酵工艺优化虽不在此详述，但在降低成本方面同样扮演重要角色。
理性菌株设计优化工业米曲霉菌株系中的β-乳球蛋白蛋白滴度
BLG是较为成熟的PF产品之一。通过理性设计策略，研究人员在一个已优化的米曲霉菌株基础上，通过激活ireA基因（一种跨膜激酶和内切核糖核酸酶，可响应内质网中未折叠蛋白而激活HAC1）和删除蛋白酶转录调控因子基因prtT，显著提升了BLG的分泌滴度。这两种改进具有叠加效应。
米曲霉中的非经典蛋白质分泌途径及其在优化蛋白滴度中的应用
系统生物学研究发现，米曲霉能通过非经典分泌途径（UPS）分泌一些无信号肽的蛋白，如卤代过氧化物酶（HPO）。为优化HPO滴度，蛋白质组学方法鉴定出三个细胞质分子伴侣Ssa2、Sse2和Hsc82为优化靶点。过表达这些分子伴侣可增加HPO的分泌量。目前正在研究UPS是否也参与了米曲霉中BLG的分泌。
经典诱变
经典诱变（CM）使用紫外辐射、化学诱变剂或离子束植入等方法，已应用数十年以改良真菌菌株性能。通过诱变，可以基于表型筛选出具有有益性状组合（如降低的蛋白酶活性、改进的分泌能力或形态）的菌株。在米曲霉中，离子束诱变已获得不产霉菌毒素的菌株。利用经典诱变进一步增加米曲霉中BLG滴度，已鉴定出涉及蛋白质运输和分泌的新基因突变，从而显著优化了BLG菌株。
经典诱变可与适应性实验室进化（ALE）结合使用以筛选改良菌株。将产物形成与微生物生长耦合的ALE策略，也被用于优化其他产品的生产。
传统食品发酵中的驯化与适应性实验室进化
在食品发酵过程中，存在着被称为“驯化”的、具有相关特性的菌株进化现象。驯化是指一个物种在与其祖先群体隔离的情况下，经过时间的推移和遗传修饰，以适应并优化其对人类的效用。
用于食品发酵（如制曲）的真菌物种的驯化是一个引人入胜的过程，它与ALE非常相似，都利用重复培养来促进优化菌株的进化。在曲发酵中，通过“接续培养”（backslopping，即不断从上一批成功的发酵产物中取部分接种物来开始新批次），生长在富含淀粉培养基上的菌株进化出更快的生长速度（由于更高的淀粉分解活性）和丧失产毒能力（如黄曲霉毒素AFL）。有趣的是，曲菌株也经历了α-淀粉酶基因拷贝数的扩增，这同样是现代工业菌株优化的标准方法。驯化在实验室内也能快速发生。
将ALE用于米曲霉菌株优化牛奶蛋白的挑战在于缺乏合适的选择系统，因为增加的BLG水平并不带来生长优势。将BLG生产与荧光或酶标签耦合，可能有助于通过ALE获得进一步改良的菌株。
真菌驯化中水平基因转移参与的最新证据
水平基因转移（HGT）在真菌物种中普遍存在。星舰可移动元件（SMEs）是最近描述的一个大型真菌转座子家族，在驯化的曲霉和青霉菌种基因组中，其丰度高于其野生近亲。米曲霉与近缘种黄曲霉相比，显示出SME数量的显著增加。这种模式在多个独立的驯化事件中重复出现，表明人造环境与SME驱动的基因获取之间存在强烈关联。因此，驯化似乎与食品相关真菌中获取水平转移的适应基因紧密耦合。
虽然真菌HGT的机制尚未完全明了，但使用SMEs可能由于其可携带大片段基因的能力，从而比CRISPR介导的基因工程以更少的步骤添加多种功能，加速滴度提升。
展望
要实现精准发酵作为养活增长人口的可行的技术，需要持续优化蛋白质生产。目前，结合系统生物学、ALE和理性设计的多种方法对于进一步改进米曲霉等工业菌株至关重要。
令人惊讶的是，驯化（食品发酵）仅需少数几代即可完成，且这一过程似乎得到了HGT的协助。因此，ALE可能代表了一种在数周内进化出优良菌株的更快方法。
我们需要结合任何合适的技术来加速菌株改良，在每种情况下切换到最佳方法，并加速蛋白滴度优化，以确保对增长人口的蛋白质供应。目前，通过独立的技术经济分析，在米曲霉中生产的BLG正达到与牛奶对应的成本持平。如果下一代基于PF的食品革命要取得成功，这是一个决定性的进展。
