于毅|黄小珍|杨芙蓉|王欣|宋春宇|邵月|朱思荣|王琦|臧恒昌|马耀红|龚伟丽
齐鲁工业大学（山东科学院）生物研究所，中国山东省济南市历城区京士东路28789号，250103
摘要
肌酐是评估肾功能的关键生物标志物，开发快速、灵敏、稳定的即时检测（POCT）生物传感器仍然至关重要。基于酶的生物传感器使用肌肽氧化酶（SOX）的三酶级联反应具有很大潜力，但在固定化后的酶活性和长期稳定性方面仍存在挑战，尤其是对于低活性SOX而言。本文报道了通过合理设计碳水化合物结合模块3（CBM3）融合到SOX中以解决这些限制。CBM3通过不同的连接器（N端使用富含脯氨酸的XP，C端使用α-螺旋结构的EAAK）分别与单体SOX的N端和C端进行基因融合，生成了CBM3-XP-SOX和SOX-EAAK-CBM3。比较分析显示，SOX-EAAK-CBM3具有更好的溶解性表达（15.96 mg/mL）、增强的室温催化活性（比野生型SOX高39.96%–56.23%）以及出色的电化学稳定性（25天，R² > 0.99）。相比之下，CBM3-XP-SOX由于连接器断裂和结构不稳定，稳定性仅持续2天。通过对N端融合连接器进行结构导向的工程改造，发现XP连接器中的K-E基序不稳定；通过截短和引入柔性甘氨酸，得到了CBM3-XG-SOX。CBM3-XG-SOX/纤维素/Pt生物传感器的电化学稳定性提高了7倍（15天），响应时间快速（19–30秒），并且对生理干扰物具有很强的抗干扰能力。血清和尿液实际样本分析证实了其高准确性（回收率：96.28%–97.88%）和优于商业试剂盒的精确度，尤其是在低或高肌酐浓度时。这项工作为通过生物信息学指导的连接器/融合位点优化来设计融合酶提供了合理的框架，克服了基于酶的生物传感器的低活性问题。CBM3融合的SOX生物传感器实现了低成本、稳定、灵敏的POCT肌酐检测，具有广泛的临床诊断和家庭健康监测应用前景。
引言
肌酐作为肌肉代谢的主要终产物，直接反映了肾小球滤过率（GFR），是急性及慢性肾脏疾病临床诊断、透析效果评估和药物性肾毒性监测的关键生物标志物[1]。典型的临床血清肌酐水平范围为0.50至1.24 mg/dL（44–110 μmol/L，年龄和性别略有差异），但在某些肾脏、甲状腺或肌肉疾病中，水平可能超过11.3 mg/dL或低于0.5 mg/dL[2]。随着即时检测（POCT）和家庭健康监测需求的增加，传统的肌酐检测方法（如Jaffé比色法、高效液相色谱法（HPLC）和质谱技术）由于需要专用设备、操作复杂和样品预处理繁琐，已无法满足这些需求。近年来，基于酶的生物传感器技术因其高特异性、操作简便、检测快速和结果可靠等优点，成为一种有前景的替代检测方法[2]。
基于酶的肌酐检测生物传感器依赖于一个复杂的三酶级联反应（肌酸酶、肌酸酶和肌肽氧化酶（SOX）：其中肌肽作为中间产物被SOX氧化脱甲基，释放出可测量的过氧化氢（H₂O₂）[3][4][5][6]。通常，酶固定的表面积小于1平方厘米，且肌酐浓度低至微摩尔级别，因此构建肌酐生物传感器的主要挑战在于最大化固定化后的酶活性以增强低浓度肌酐的检测能力[7]。来自不同来源的SOX存在结构异质性，根据亚基数量可分为单体、二聚体和四聚体形式[8]。单体SOX（mSOX）是氨基氧化酶家族的典型成员，具有相对保守的结构特征：它通常与FAD形成共价结合[8α-(S-半胱氨酰)FAD]，相对分子质量约为40 kDa，包含两个功能域——黄素域和催化域[8][9]。相比之下，多聚体SOX表现出较大的多样性：异二聚体SOX由两个不同的亚基（α和β）组成[10]，异四聚体SOX由四个不同的亚基（α、β、γ、δ）组成，分子量分别为110、44、21和10 kDa，并含有三种辅因子（NAD、FMN、FAD）、一个Zn²⁺结合基序和一个二氢叶酸结合位点[11]。此外，从Pyrococcus horikoshii基因组中预测的SOX采用（αβ）4异八聚体构型。在固定化过程中，多聚体SOX变体容易发生亚基解离或构象破坏。因此，单体SOX更有利于实现高酶活性保留，从而在应用中实现高效稳定的固定化过程。
除了酶结构的影响外，固定化方法也是决定酶活性保留率的关键因素[12]。陈曦等人证明，使用戊二醛交联mSOX-6His仅保留了其原始酶活性的5%。即使随后使用3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）和四甲基正硅酸盐（TMOS）进行“自固定”，由于这种固定化策略的非定向性，酶活性仍损失了24%–60%[13]。随着蛋白质工程的进步，将亲和基序融合到蛋白质分子中以实现可控方向的固定化已被证明是一种有效策略，可以保持蛋白质的二级结构和酶活性[14]。在我们之前的研究中，利用碳水化合物结合模块（CBMs）与纤维素之间的强亲和力，将CBMs引入葡萄糖氧化酶（GOD）、葡萄糖脱氢酶（GDH）和尿酸氧化酶（UOX）中，构建了固定的酶生物传感元件，显著提高了传感性能。基于这些成功案例，将CBM整合到SOX中以实现可控的纤维素修饰界面固定化是可行的。然而，据报道，低活性SOX的稳定性相对较差[13]。因此，对SOX进行工程改造更能代表在实际应用中遇到的低活性酶传感的挑战。
虽然构建CBM融合酶具有前景，但也面临一些挑战，包括个别结构域（如CBM和SOX）的错误折叠导致包涵体形成、连接器本身的稳定性不足和易断裂以及生物活性受损[15][16]。为了避免潜在问题，必须考虑一些关键因素，其中连接肽的合理设计和选择至关重要。合适的连接器不仅物理上连接两个蛋白质结构域，还能有效分离它们，避免在折叠和催化过程中的相互干扰，从而确保融合酶的正确折叠、稳定性和功能活性[17]。在合理设计连接器时，需要考虑的关键属性包括组成（决定刚性和亲水性）和长度。连接器通常可分为两类：柔性和刚性。柔性连接器通常由小分子极性氨基酸（如甘氨酸和丝氨酸）组成，具有高流动性和无结构特性，例如poly-glycine-serine基序（GGGGS）n（n = 3–4）提供了高灵活性和亲水性，使连接的域能够独立表现[18][19]。刚性连接器则设计成稳定的二级结构，最常见的是α-螺旋结构，保持结构域之间的固定距离和方向。常用的刚性连接器包括（EAAAK）n重复序列（n = 2–5）和富含脯氨酸的（XP）n序列（X可以是任何氨基酸，优选丙氨酸、赖氨酸或谷氨酸），通过提供结构刚性来最小化不必要的结构域相互作用[20]。选择柔性和刚性取决于融合蛋白的功能需求，但预测选定序列是否为最佳选择或其氨基酸序列是否会对融合设计产生影响仍然具有挑战性。
最近，合成生物学和生物信息学的结合为融合酶的关键结构-功能关系提供了深入见解，例如结构域之间的空间取向和动态相互作用。这些理解为它们的合理设计奠定了基础。生物信息学工具（如AlphaFold和GROMACS）在连接器稳定性工程中发挥了不可或缺的作用。AlphaFold能够实现高精度的蛋白质结构预测，直观展示连接器长度效应和两个融合结构域的折叠构象[21]。GROMACS作为一种广泛采用的分子动力学（MD）模拟平台，基于初始静态结构模拟蛋白质系统的动态演变，通过构建合理的力场参数和建立模拟环境来模拟生理条件（如温度、压力和溶剂模型），从而实现对蛋白质从静态构象到动态行为的全面时空表征。除了捕捉原子级别的运动特征（如键长扩展、键角波动和二面角旋转）外，该模拟过程还揭示了控制蛋白质构象转变、功能位点动态调节以及与局部微环境相互作用的机制[22]。这些工具显著减少了实验负担，加速了更灵敏和低成本融合酶生物传感器的开发。
在本研究中，通过端到端基因融合方法系统地设计了一系列CBM融合的SOX，以开发改进的生物传感元件。通过对影响融合酶稳定性的因素的研究，发现N端和C端连接器区域内的特定残基对SOX的结构完整性有重要影响。在合理的生物信息学分析指导下，对这些不稳定残基进行了战略性截短，得到了稳定的融合酶。实验验证表明，这种优化显著提高了相应基于SOX的生物传感器的稳定性。这项工作为设计具有可调性质的融合酶提供了合理的框架，为构建高性能生物传感器平台提供了稳健的策略。
材料与化学试剂
使用的基因表达载体是pET-30a(+)，质粒构建由Genewiz（中国苏州）完成。大肠杆菌 DH5α用于扩增构建的质粒，大肠杆菌 BL21(DE3)用于蛋白质表达。
4-氨基安替比林、50%（v/v）戊二醛（GA）和牛血清白蛋白（BSA）购自Sangon Biotech（中国上海），苯酚购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（中国北京），辣根过氧化物酶（HRP）购自...
CBM融合SOX的构建与表征
本研究选择理论分子量为43.1 kDa的单体SOX作为亲本酶。为了探索融合位点对酶性能的影响，分别通过不同的柔性肽连接器（N端融合使用-XP连接器，C端融合使用-EAAK连接器）将CBM3基因融合到SOX的N端和C端。两种融合策略均生成了理论分子量为60.78 kDa的构建体（图1A）。
结论
本研究通过合理的基因设计和生物信息学指导的优化，系统地设计了CBM3融合的SOX变体，开发了用于肌酐检测的高性能生物传感元件。通过研究融合位点、连接器拓扑结构和结构稳定性对酶活性、固定化效率和电化学性能的影响，我们建立了适用于生物传感器应用的融合酶工程框架。
CRediT作者贡献声明
于毅：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，可视化，验证，方法学，研究，数据整理。
黄小珍：方法学，研究。
杨芙蓉：方法学，研究。
王欣：方法学。
宋春宇：可视化。
邵月：方法学，研究。
朱思荣：方法学，研究。
王琦：验证。
臧恒昌：方法学，研究。
马耀红：写作 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFC3401302）、国家自然科学基金（32101222）、济南高校人才项目（202228084）以及齐鲁工业大学（山东科学院）的关键创新项目（2024ZDZX03）的资助。
