血浆，这种在人体内循环流动的淡黄色液体，不仅是运输养分和废物的载体，更是一个蕴含健康与疾病秘密的巨大信息宝库。科学家们通过质谱技术解析血浆中的蛋白质组成，即血浆蛋白质组学，希望从中找到诊断疾病、监测疗效的生物标志物。在这个过程中，通常需要对照样品，而商业来源的健康捐献者血浆因其易于获取，常被用作工作流程优化的“标准品”或临床研究的“对照品”。然而，一个看似理所当然的假设潜藏着隐患：不同商业来源制备血浆的标准操作程序（Standard Operating Procedure, SOP）是可比的、一致的。但事实果真如此吗？如果不同供应商在处理血液（比如离心速度、储存时间、抗凝剂选择）时存在差异，这些差异是否会“烙印”在最终的血浆蛋白质组中，从而混淆甚至误导后续的科研发现？这正是《Journal of Proteome Research》上发表的这项研究试图回答的核心问题。
为了探究商业血浆SOP差异带来的影响，研究人员设计了一项严谨的实验。他们从美国五家不同的商业供应商（文中以Source 1-5指代）采购了健康捐献者的血浆样品，并特意控制了捐赠者性别、年龄、冻融次数等因素。研究采用了两种蛋白质组学工作流程进行对比：一种是基于顺磁珠的蛋白质富集策略（ENRICHplus试剂盒），用于回收低丰度蛋白；另一种是常规的直接酶解方法（iST-BCT试剂盒）。制备好的肽段样本使用两种不同的质谱仪（Thermo Fisher的Exploris 480和Bruker的timsTOF HT）在数据非依赖采集模式（Data-Independent Acquisition, DIA）下进行分析，并辅以CHIMERYS和DIA-NN两种搜库算法进行数据解析，以确保结果的稳健性。同时，他们还通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测了血小板特异性蛋白（PF4和P-选择蛋白）的水平，以验证质谱发现。
血浆蛋白质数量因商业来源而异
研究首先发现，不同来源血浆的蛋白质鉴定数量存在巨大差异。在使用Exploris 480质谱仪和CHIMERYS算法分析ENRICHplus富集的样本时，Source 1和2仅鉴定出约720-787个蛋白质，而Source 3-5则超过了1500个，其中Source 3高达1682个，差异超过两倍。使用更高灵敏度的timsTOF HT平台时，虽然各来源鉴定到的蛋白质总数都大幅提升（如Source 1达3480个，Source 3达5434个），但来源间的差异依然明显。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）清晰显示，技术重复样本能按商业来源聚类，初步表明不同来源的血浆具有独特的蛋白质组“指纹”。
常规血浆蛋白质组学方法未能揭示的主要变异源
与ENRICHplus富集方法相比，常规的iST-BCT（“neat plasma”）方法鉴定到的蛋白质总数少得多（237-336个），且其蛋白质组分布无法清晰区分出ENRICHplus方法所揭示的来源间巨大差异。这提示，若不采用高深度的富集技术，商业来源间的系统性差异可能被掩盖，无法在常规分析中被察觉。
载脂蛋白与血小板蛋白的差异富集
通过差异分析和基因集富集分析，研究人员深入挖掘了蛋白质组差异背后的生物学含义。他们将五个来源分为两组：Group 1（Source 1和2）和Group 2（Source 3-5）。分析显示，Group 1中显著富集的蛋白质与脂蛋白生物学和补体功能相关，其中包含54种已知的载脂蛋白。相反，Group 2中显著富集的蛋白质则与血小板活化、膜运输和囊泡介导的转运通路相关，包含了87种血小板蛋白。ELISA实验进一步证实，Group 1血浆中可溶性的血小板因子4（PF4）和膜相关的P-选择蛋白水平确实低于Group 2。对蛋白质丰度谱进行聚类分析，也明确将蛋白质分为两个主要集群：一个富含载脂蛋白（在Group 1中丰度高），另一个富含血小板蛋白（在Group 2中丰度高）。
血浆单采（Apheresis）操作提升了蛋白质组得率
为了追溯差异根源，研究团队调查了各供应商的血浆制备SOP。关键发现浮出水面：Source 5的血浆来自单采献血术，此过程中血液经过特殊过滤，可能无意中去除了一部分载脂蛋白，这反而使得中低丰度蛋白更易被检测到，从而提高了总蛋白鉴定数。Source 3则允许全血在离心前于4°C储存长达4小时，已知较长的血液储存时间会增加乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血中的血小板活化，这解释了其血小板蛋白信号升高的现象。而Source 4的血浆在运输过程中处于室温，这可能是导致其蛋白质组呈现异常的另一因素。Source 1和2采用了采集后立即离心的标准协议，因此它们的蛋白质组最为相似。这些SOP细节的差异，完美地对应了质谱数据所观察到的蛋白质组模式分组。
研究结论与重要意义
本研究得出结论，商业血浆制备过程中的标准操作程序（SOP）差异，特别是涉及离心方案、储存时间和单采程序等前处理步骤，是导致血浆蛋白质组显著变异的主要来源。这些差异会显著影响载脂蛋白和血小板相关蛋白的丰度，进而对基于血浆蛋白质组学的生物标志物发现和机制研究产生潜在影响。
其重要意义在于：
- 1.
警醒作用：研究强烈提醒科学界，在使用商业血浆作为对照或进行多中心研究时，不能默认其均一性。必须主动询问、核实并报告血浆样品的前处理SOP细节，尤其是离心力、时间、温度以及是否涉及单采等关键参数。
- 2.
技术验证：研究表明，基于纳米颗粒的蛋白质富集技术（如ENRICHplus）比常规方法更能灵敏地揭示这些前处理差异，强调了在方法学开发和质量控制中选择高深度分析技术的重要性。
- 3.
临床启示：如果目标疾病机制涉及血小板活化（如心血管疾病、感染、癌症）或脂蛋白代谢，使用不同SOP制备的血浆可能引入严重的混淆因素，甚至掩盖真实的疾病信号。因此，根据研究目的谨慎选择血浆来源和了解其制备流程至关重要。
- 4.
推动标准化：这项工作为血浆蛋白质组学研究的样本制备标准化提供了实证依据，强调了在实验设计阶段严格控制前分析变量（preanalytical variables）的必要性，特别是对于回顾性队列研究，其样本处理历史已无法更改，解读数据时需格外谨慎。
总之，这项研究如同一枚“探针”，通过高精度的质谱分析，成功“显影”了通常被忽视的商业血浆制备流程差异，并量化了其对下游蛋白质组学结果的深远影响。它不仅增进了人们对血浆样本复杂性的理解，也为未来更可靠、可重复的血浆生物标志物研究奠定了重要的方法论基础。
