戊二酰葡萄糖和单宁酸通过保护黏膜屏障免受产气荚膜梭菌的破坏，从而改善肠道健康

金黄色葡萄球菌通过降解粘液层引发肠炎，鞣酸类物质（PGG和TA）通过抑制细菌增殖、破坏生物膜并增强粘液屏障功能发挥抗腹泻作用。研究采用蛋白质组学、分子对接和原子力显微镜等技术，发现PGG和TA通过结合粘液蛋白MUC2增强粘液弹性，同时改变细菌膜蛋白结构诱导其死亡，并调节炎症因子（IL-1β、IL-6）和肠屏障标志物（Ascl2、Lgr5）。实验首次阐明鞣酸与病原体-粘液层互作的分子机制，为感染性腹泻治疗提供新策略。

徐慧萍|李光|龚璐|吕增鹏|郭玉明

中国农业大学动物科学与技术学院动物营养与饲料国家重点实验室，北京100193，中国

摘要

背景

产气荚膜梭菌会破坏肠道黏液层，进一步引发肠道感染和腹泻。没食子单宁可以保护肠道并缓解腹泻，但其作用机制尚不清楚。

目的

本研究旨在阐明五没食子酰葡萄糖（PGG）和单宁酸（TA）抑制产气荚膜梭菌、保护肠道黏液层以及缓解腹泻的机制。

方法

通过蛋白质组学、拉曼光谱和Zeta电位研究了细菌的杀菌活性和生物膜破坏情况。利用原子力显微镜、黏弹性测定和分子动力学模拟分析了黏液层。通过产气荚膜梭菌-黏液-上皮细胞模型研究了PGG和TA对上皮细胞的保护作用。建立了产气荚膜梭菌小鼠模型以探讨PGG和TA对小鼠的保护效果。

结果

在125 µg/ml浓度下，PGG和TA表现出强烈的杀菌活性，能够抑制细菌滑动、破坏生物膜形成并诱导细菌聚集。膜蛋白分析显示其改变了膜通透性、群体感应、氧化磷酸化和ABC转运蛋白相关通路的相关基因表达。这些作用增加了细菌的压力并加速了细胞死亡。分子对接实验确认PGG和TA通过特定的分子间作用与膜蛋白相互作用。产气荚膜梭菌感染会降低黏液的黏弹性并增加表面粗糙度。在7.8 µg/ml浓度下，PGG和TA通过分子间作用与黏蛋白2的半胱氨酸富集区结合，从而增强黏弹性、改善交联并减少表面粗糙度。在共培养模型中，PGG或TA调节了炎症细胞因子的表达并提高了细胞活力。在产气荚膜梭菌感染的小鼠中，PGG和TA显著减轻了体重下降，并有效恢复了内层黏液层的厚度和杯状细胞数量（p < 0.05），同时抑制了促炎细胞因子（IL-1β和IL-6;p<0.05）的过度表达，并下调了异常升高的肠道屏障和增殖标志物（Ascl2和Lgr5;p<0.05）。相关性分析进一步表明，受损的物理黏液防御机制触发了黏膜免疫信号传导和上皮更新的补偿性上调。

结论

本研究表明，PGG和TA通过双重机制发挥抗腹泻作用：抑制产气荚膜梭菌的增殖并增强肠道黏液屏障的完整性，首次阐明了单宁与病原体-黏液层相互作用背后的分子调控途径，为治疗感染性腹泻提供了新的靶向策略。

引言

肠道黏液是覆盖肠道的重要保护屏障，具有防御、保护和调节功能。黏液由两层组成：一层附着在上皮细胞上，另一层属于松散层（Sardelli等人，2022年）。黏蛋白上的多种单糖组成、位置、立体化学连接特性和化学修饰共同作用，使黏液具有黏性，能够在肠道和上皮细胞之间形成物理化学屏障（Johansson等人，2008年；2011年）。这种屏障的损伤与黏膜疾病密切相关，包括炎症性肠病。

共生菌和致病菌都进化出了定植黏液层的策略，通常通过产生能够降解复杂糖类的碳水化合物活性酶来实现（Etzold和Juge，2014年）。其中，产气荚膜梭菌是一种常见的肠道病原体，可引起感染性腹泻。它可以分解黏蛋白上的特定O-糖链（Fujita等人，2011年；Ficko-Blean等人，2012年），并分泌额外的黏蛋白降解酶。这种黏液溶解活性会导致多种胃肠道疾病，包括食物中毒、腹泻、胃肠炎和坏死性肠炎（Gharib-Naseri等人，2019年；Rood等人，2018年）。

中国五倍子（Rhus chinensis Mill.）是中医中最重要的草药之一。历史上一直用于治疗腹泻和痢疾等疾病，以及预防创伤出血（Yang等人，2017年）。其核心成分之一是没食子单宁（GTs）。GTs具有很强的收敛作用，能够通过与肠道蛋白结合形成不溶性复合物来预防腹泻。这一特性使其在治疗胃肠道疾病方面特别有效。此外，这种收敛作用还能通过干扰微生物代谢和破坏细菌膜完整性来直接抑制细菌增殖（Huang等人，2018年；Liu等人，2013年）。然而，GTs的作用机制尚未完全阐明，尤其是产气荚膜梭菌与肠道黏液屏障之间的相互作用机制仍需进一步研究。

基于这些先前的研究，我们假设GTs通过双重机制缓解腹泻：一方面，其收敛作用通过将黏液交联成更密集的网络来增强肠道屏障的完整性，防止细菌定植；另一方面，同样的收敛作用会破坏细菌细胞膜，从而抑制其增殖。为此，我们选择了两种结构相关的GT单体——PGG和TA（结构见补充图1）——它们具有相同的五没食子酰葡萄糖核心，但在没食子酰基的数量上有所不同。这种比较有助于探讨结构复杂性如何影响抗菌和屏障保护功能，为理解没食子单宁的结构-活性关系及管理感染性腹泻的潜在机制提供见解。

材料

PGG（CAS编号14937-32-7，纯度≥98%）购自成都安赛西生物技术有限公司（中国四川成都）。TA（CAS编号1401-55-4，纯度≥98%）购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。

抑菌指标的测定

产气荚膜梭菌（CVCC52型）在厌氧条件下培养至对数生长阶段。制备了TA（4 mg/ml）或PGG（2 mg/ml）的系列稀释液。含有1 ml稀释细菌悬液（10⁶ CFU/ml）的试管被进行培养

PGG和TA对产气荚膜梭菌增殖、运动性和生物膜形成的影响

PGG和TA的最低抑菌浓度（MBC）为125 µg/ml（图1A、B），而克林霉素的MBC为31.2 µg/ml（图1C）。在4×MBC浓度下，PGG在120分钟内有效杀死了细菌；而在2×MBC浓度下，240分钟内杀死了细菌。同样，TA在4×MBC和2×MBC浓度下也能在120分钟内有效杀死细菌，而达到2×MBC浓度则需要360分钟。克林霉素显示出最强的活性，且没有可见效果

讨论

单宁对细菌外酶、毒素、黏附蛋白、表面转运蛋白、生物膜形成和细菌运动性的抑制作用已被广泛研究（Girard和Bee，2020年；Farha等人，2020年；Girard等人，2018年；Yang等人，2022年；Durgadevi等人，2020年）。这些发现强调了单宁在预防各种病原体和抗菌素耐药机制方面的潜力。研究表明，厌氧菌的抗生素耐药性

结论产气荚膜梭菌通过降解黏蛋白破坏肠道黏液层，损害黏液屏障功能，并引发肠道上皮炎症，从而导致腹泻。没食子单宁可以抑制产气荚膜梭菌的生长和生物膜形成，改变其膜蛋白结构，并激活加速细菌死亡的关键通路。此外，PGG和TA通过分子间作用与MUC2结合，防止产气荚膜梭菌进一步损伤

数据声明

本研究产生的所有数据均可根据请求向相应作者索取。所有数据均为内部生成，未使用任何第三方数据生成服务。所有作者同意对工作的所有方面负责，确保数据的完整性和准确性。

作者贡献

徐慧萍：数据整理、正式分析、初稿撰写。李光：方法学设计、概念构思。龚璐：实验研究、监督。吕增鹏：撰写、审稿和编辑；郭玉明：撰写、审稿和编辑、资金获取。

资金来源

本研究得到了中国农业研究系统计划（项目编号CARS-41-G04）的支持。

作者协议

作者确认所有作者均已审阅并批准了手稿的最终版本。作者保证该工作是原创的，尚未在其他地方发表，也未被其他机构考虑发表。

版权声明

作者同意在 manuscript 被接受后，授予出版商独家权利以全部或部分形式发表该作品。

致谢

作者感谢动物营养与饲料国家重点实验室的工作人员，特别是那些参与动物营养研究的人员，在实验过程中提供的宝贵帮助。