负载花青素的酪蛋白纳米颗粒对冷冻保存后兔精子的保护作用：抗氧化与抗凋亡机制的探究

时间：2026年3月28日

来源：Tissue and Cell

编辑推荐：

本研究评估了槲皮素及其负载乳清蛋白纳米颗粒在兔精子冷冻保护中的效果，发现纳米颗粒显著提升精子活力、膜完整性和运动能力，并通过抗氧化和抗凋亡机制减少冷冻损伤。

作者名单：Elsayed S.I. Mohammed、Mohamed Shawky El Sayed、Mohamed Ashour、Michelyn Haroun、Roshmon Thomas Mathew、Ramya Ahmad Sindi、Nawal Al-Hoshani、Sameh A. Abdelnour、Asmaa Sheiha

研究机构：沙特阿拉伯法赛尔国王大学鸟类研究中心，Hofuf-420，Al-Ahsa 31982

摘要

尽管冷冻保存在遗传物质保存方面具有重要意义，但该过程会通过氧化应激对精子造成严重损伤。本研究的目的是评估天然类黄酮素（chrysin，简称CY）与载有类黄酮素的酪蛋白纳米颗粒（CY-CasNPs）作为抗氧化添加剂在兔子精子冷冻保存中的保护效果。研究共收集了72份精液样本（来自可育雄性兔子），并将其稀释在Tris缓冲液中。样本被分为三组：对照组（不添加任何添加剂）、添加100 μg/mL CY的组以及添加CY-CasNPs的组，然后按照标准程序进行冷冻保存。结果发现，与对照组和单纯添加CY的组相比，CY-CasNPs组显著提高了精子的存活率、膜完整性、前进运动能力及运动学参数（P < 0.001）。透射电子显微镜观察显示，CY-CasNPs有效保持了精子的超微结构完整性的稳定。尤其是顶体帽和质膜部分，几乎未受到冷冻损伤的影响。此外，CY-CasNPs还通过上调酶活性（TAC、CAT和GSH-Px）并降低氧化指标（MDA、NO和H₂O₂）的水平（P < 0.05），表现出较强的抗氧化能力。CY-CasNPs组中具有完整顶体的活精子比例显著高于其他两组（54.28%，而对照组和单纯添加CY的组分别为47.16%和36.84%，P < 0.01）。进一步的研究表明，CY-CasNPs能够抑制Caspase-3和Bax的活性，并上调Bcl-2的表达（P < 0.01），从而发挥抗凋亡作用。综上所述，将类黄酮素封装在酪蛋白纳米颗粒中可有效发挥抗氧化和抗凋亡作用，通过调节凋亡相关基因表达并恢复细胞内的氧化还原平衡来保护精子超微结构。这些发现表明，纳米颗粒介导的递送系统在精子冷冻保存中具有巨大潜力，有望提升兽医辅助生殖技术的效率。

引言

人工授精（AI）是现代畜牧业生殖生物技术的核心，它提供了一种经济高效的遗传物质传递方式，有助于大规模后代检测。该技术显著加快了动物种群的遗传改良速度，从而提高了繁殖效率并促进了生物多样性保护（Ciornei等人，2024年）。然而，冷冻保存过程本身会导致精子质量与功能的下降，这与氧化应激的增加密切相关（Zhang等人，2024年）。在冷冻保存过程中，精子会暴露于多种应激因素下，如低温冲击、温度波动和渗透压变化（Abdelnour等人，2022a；Tran等人，2025年），同时体内的抗氧化防御系统也会受到削弱（Dessouki等人，2024年）。此外，冷冻引起的氧化应激还会引发精子顶体反应，并导致质膜和顶体帽的损伤（Kujoana等人，2024年），进而降低精子的穿透卵细胞的能力。这些生理变化还会影响精子的运动能力并引发线粒体功能障碍（Abdelnour等人，2022a；Zhang等人，2024年）。由于精子的特殊生理结构，它们极易受到氧化损伤；其细胞质体积极小，所含抗氧化酶数量有限，限制了其自我修复能力（Abdelnour等人，2022a）。为提高冷冻保存后精子的质量，目前正积极研究先进的冷冻保存技术和富含多种生物活性添加剂的精液稀释剂（Abdelnour等人，2022a；Dessouki等人，2024年；Sindi等人，2025年）。将天然抗氧化剂加入冷冻介质中是一种有效策略，可以增强抗氧化防御机制，稳定线粒体能量代谢，并保持精子解冻后的存活率和运动能力（Abdelnour等人，2022b；Abdelnour等人，2024年）。因此，具有强抗氧化特性的天然植物越来越受到生殖生物技术的关注，因为它们具有显著的治疗和细胞保护作用。

类黄酮素（Chrysin，5,7-二羟黄酮）是一种广泛存在于西番莲属植物、蜂蜜和蜂胶中的黄酮类化合物，具有多种药理活性（Adangale和Wairkar，2022年），包括抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤和抗炎作用（Talebi等人，2024年）。研究表明，类黄酮素可通过抑制MAPK信号通路发挥抗炎作用（Adangale和Wairkar，2022年），从而减轻肺部损伤；此外，它还能缓解脂多糖引起的急性肺损伤（Koc等人，2020年）或脑损伤（Lee等人，2017年），通过改善血管通透性和减轻肺部炎症。关于类黄酮素在生殖健康和精子质量方面的应用研究仍相对有限。例如，Altawash等人（2017年）发现，每日口服75 mg类黄酮素12周可显著改善精子的生殖健康和质量，通过调节脂肪酸组成、睾丸功能和睾酮水平实现；Zhandi等人（2017年）发现，鸡每天口服75 mg类黄酮素可减轻冷冻保存对精子质量和生育能力的负面影响。类似的研究结果也在啮齿动物模型中得到验证（Ciftci等人，2012年）。类黄酮素通过增强抗氧化状态和睾酮合成，改善了大鼠精子的功能并减少了精子异常。Saleh等人（2025年）发现，类黄酮素能够剂量依赖性地减轻环磷酰胺引起的氧化损伤、炎症和激素紊乱，并防止铁调节蛋白的抑制。最近的研究还探索了利用天然纳米颗粒（如载有肉桂酸的纳米脂质体（Elmorsy等人，2025b）和载有迷迭香酸的壳聚糖纳米颗粒（Shalaby等人，2026年）来改善水牛精子的质量，利用它们的抗氧化和抗凋亡特性。尽管类黄酮素具有广泛的治疗潜力，但由于其水溶性较差和不良的药代动力学特性，其临床应用受到限制。显著的首过代谢和快速系统清除导致其生物利用度低，限制了其在体内的效果，因此需要开发先进的递送系统。纳米颗粒作为一种先进的药物递送平台，已被广泛用于提高疏水性药物的递送效率（Mall等人，2025年）。

酪蛋白（Cas）是牛奶中的主要磷酸蛋白，由于其高稳定性、无毒性和良好的生物相容性及可降解性，成为理想的递送载体（Elzoghby等人，2011年）。从结构上看，酪蛋白是一种两亲性嵌段共聚物，可在水中自组装成核壳纳米结构（Tang等人，2024年）。在这种结构中，疏水段聚集形成内部核心，而亲水链向外延伸形成保护性外壳（Shapira等人，2010年）。这种结构有利于将疏水化合物化学结合或物理包裹在核心内，为先进的纳米药物递送策略提供了基础（Tang等人，2024年）。虽然壳聚糖常被用作纳米载体，但其乳化过程通常需要酸性条件；相比之下，酪蛋白具有更优的乳化性能和独特的胶束结构，能够提高疏水药物的包封效率（Sadiq等人，2021年）。目前尚未探索将载有类黄酮素的酪蛋白纳米颗粒（CY-CasNPs）应用于哺乳动物精子的冷冻保存。本研究旨在开发一种CY-CasNPs递送系统，以克服类黄酮素的溶解限制，研究其对冷冻保存后精子质量、抗氧化特性和超微结构的影响，以及其对凋亡相关基因表达的调节作用。我们推测，在冷冻保存前向精液稀释剂中添加CY-CasNPs可通过调节氧化还原状态、增强细胞功能和抑制凋亡途径来改善精子质量和功能。因此，本研究旨在评估CY-CasNPs对冷冻保存过程中精子损伤的保护作用，并具体评估解冻后精子的质量、运动学参数、凋亡标志物、氧化还原平衡和超微结构完整性。

类黄酮素载入酪蛋白纳米颗粒（CY-CasNPs）的制备

根据Tang等人（2024年）的方法，将含有β-酪蛋白（35%）、αS2-酪蛋白（10%）和κ-酪蛋白（15%）的粉末溶解在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，搅拌4小时后得到酪蛋白胶束，其表面具有亲水性；随后将类黄酮素粉末溶解在0.1 M NaOH中，保持高pH值10分钟以防止降解，制备出1 g/100 mL的类黄酮素溶液。

CY-CasNPs的表征

如图1所示，CY-CasNPs呈球形且分散良好，聚集程度较低（图1A），粒径分布在75至133 nm之间（图1B）。动态光散射（DLS）分析显示，CY-CasNPs的平均粒径为170 nm，多分散指数（PDI）为0.142，表明其粒径分布较宽（图1C）。Zeta电位测量显示其表面带正电荷。

讨论

精子冷冻保存是人工授精和动物遗传改良的关键技术，但该过程会损害精子的质量、结构和生理功能。这种损伤主要由氧化应激、冰晶形成、快速温度变化（低温冲击）和渗透压变化引起。这些冷冻应激因素共同导致精子存活率、运动能力和受精能力的显著下降。为了减轻这些损伤……

结论

本研究结果表明，在冷冻精液中添加100 μg/mL的CY-CasNPs可显著提高精子的存活率、前进运动能力和运动学参数。这种处理有效减轻了冷冻保存引起的超微结构损伤和凋亡现象，这可能是由于纳米包裹的类黄酮素具有强大的抗氧化和抗凋亡作用。具体而言，CY-CasNPs通过降低MDA、H₂O₂和NO的水平来减轻氧化应激和硝化应激。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响研究结果或结论的财务、个人或其他利益冲突。

资助信息

本研究得到了沙特阿拉伯法赛尔国王大学科学研究处及研究生院的支持。资助项目编号：PNURSP2026R437，资助单位为沙特阿拉伯利雅得的Princess Nourah bint Abdulrahman大学。

作者贡献说明

Elsayed S.I. Mohammed： 负责撰写初稿、数据可视化及结果验证。 Mohamed Shawky El Sayed： 负责撰写初稿、数据可视化及结果验证。 Mohamed Ashour： 负责撰写初稿、结果验证及软件应用。 Nawal Al-Hoshani： 负责撰写初稿、数据可视化及结果验证。 Abdelnour Sameh： 负责审稿与编辑、撰写初稿、结果验证及项目监督、概念设计。 Asmaa Sheiha： 负责审稿与编辑、撰写初稿、数据可视化及方法学设计。