摘要：天冬氨酸是所有生物体中一种重要的蛋白质氨基酸。许多微生物可通过多种生物合成过程产生天冬氨酸，将其用于能量生产以及作为合成其他生物分子（如氨基酸和核苷酸）的前体。肠病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium, S. Tm）已发展出在炎症肠道中扩增期间将天冬氨酸作为营养源获取的机制。然而，S. Tm在感染期间如何应对天冬氨酸饥饿仍属未知。为解决这一知识空白，研究人员利用鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠模型，探究了由aspC基因编码的双向天冬氨酸氨基转移酶对体外及宿主定殖期间生长的依赖性。AspC可互变天冬氨酸与三羧酸（TCA）循环中间体草酰乙酸，据推测其可在饥饿期间支持S. Tm细胞对天冬氨酸的需求，或通过草酰乙酸合成支持TCA循环的燃料补充。在此，研究人员发现aspC的缺失导致肠道特异性的S. Tm定殖缺陷，且该缺陷随感染进程加剧。重要的是，在CBA/J小鼠中，aspC对于S. Tm的系统性定殖并非必需。此外，研究人员报道称，在体外呼吸炎症衍生的电子受体期间，aspC的缺失会导致显著的生长缺陷。通过TCA酶缺失或补充TCA中间体（如草酰乙酸）中断氧化型TCA循环进程，消除了ΔaspC S. Tm在体外的观测缺陷，这表明在呼吸过程中，AspC需要分解代谢天冬氨酸以支持TCA循环。综上所述，研究人员报道了AspC在炎症期间通过支持能量生成，以肠道特异性方式在S. Tm发病机制中发挥关键作用。
论文解读：Aspartate aminotransferase is required for Salmonella expansion in the inflamed gut via TCA anaplerosis
研究背景与引言
哺乳动物肠道虽然是主要的消化场所，但对于鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium, S. Tm）等潜在的入侵性肠病原体而言，却是一个营养匮乏的区域。这种匮乏源于常驻肠道微生物群（gut microbiota）对主要营养生态位的占据，它们通过直接分解代谢和支持宿主上皮细胞代谢来减少潜在入侵者所需的营养。尽管已知细菌对氨基酸饥饿高度敏感并会激活严谨反应（stringent response），但具体哪些氨基酸是肠病原体在与复杂微生物群竞争中必需的仍不清楚。既往研究表明，S. Tm需要天冬氨酸（aspartate）通过天冬氨酸氨裂解酶AspA进行富马酸盐呼吸以在炎症肠道中扩增。此外，AspC作为一种天冬氨酸氨基转移酶，已被证明参与巨噬细胞内沙门氏菌的复制及细胞大小的维持。然而，AspC介导的天冬氨酸原养型（prototrophy）如何影响病原体在肠道定殖期间的适应性，特别是在依赖厌氧呼吸克服常驻微生物群的炎症环境下，仍存在知识空白。本研究旨在阐明AspC在S. Tm肠道致病机制中的作用。
关键技术方法
研究人员构建了S. Tm IR715菌株的aspC基因缺失突变株及其互补株，利用λ-Red重组系统进行遗传操作。研究采用了CBA/J小鼠模型，分别通过腹腔注射（intraperitoneal, IP）和经口灌胃（intragastric, IG）两种途径进行竞争性感染实验，以评估细菌在系统性部位（肝、脾）和肠道腔内的定殖能力。在体外实验中，使用了无碳E（NCE）基础培养基辅以甘油或葡萄糖作为碳源，并添加了硝酸盐（nitrate）、四硫磺酸盐（tetrathionate）等炎症衍生的电子受体，以及猪胃粘蛋白（porcine gastric mucin）来模拟炎症肠道环境。通过定量PCR（qPCR）分析基因表达，并利用竞争指数（Competitive Index, CI）计算来评估细菌适应性。
研究结果
S. Typhimurium requires AspC during murine models of gastroenteritis
为了探究AspC在体内不同感染部位的必要性，研究人员首先通过腹腔注射进行了系统性感染。结果显示，在肝脏、脾脏和腹腔灌洗液中，野生型（WT）S. Tm与ΔaspC突变株的细菌载量及竞争指数均无显著差异，表明AspC对于S. Tm在系统性部位的存活并非必需。相比之下，在经口感染的胃肠炎模型中，ΔaspC突变株表现出显著的肠道特异性扩增缺陷。在感染后第5天和第9天的粪便样本中，野生型菌株相对于ΔaspC突变株的竞争指数分别达到约10倍和100倍。组织分析进一步证实，这种缺陷局限于盲肠和结肠内容物，而在系统性器官中未观察到差异。单感染实验也验证了这一结论，表明aspC有助于S. Tm在胃肠炎后期阶段的肠道定殖。
Loss of T3SS does not significantly alter the dependence of aspC in S. Tm
鉴于ΔaspC S. Tm的缺陷随时间推移而增加，与胃肠炎发病期吻合，研究人员推测该表型可能依赖于炎症。通过构建缺失invA和spiB（ΔinvAΔspiB）从而失去III型分泌系统（T3SS）诱导炎症能力的无毒力背景菌株进行竞争性感染实验。结果显示，在无T3SS的情况下，aspC缺失菌株在感染早期（第1天）即表现出比野生型背景更严重的定殖缺陷。虽然在粪便样本中野生型背景与ΔinvAΔspiB背景下的竞争指数存在差异，但在盲肠和结肠内容物中，两种背景下的ΔaspC突变株均被其亲本菌株显著竞争淘汰。体外厌氧生长实验表明，在模拟健康肠道（LB或葡萄糖NCE）条件下，ΔaspC无生长缺陷；但在模拟炎症肠道（甘油加硝酸盐或四硫磺酸盐）条件下，ΔaspC在0或0.1 mM天冬氨酸限制条件下表现出显著的生长和适应性缺陷，而补充10 mM天冬氨酸则可挽救该缺陷。
Loss of AspC results in altered biosynthetic processes in S. Tm during nitrate respiration
为了探究AspC在硝酸盐呼吸中的作用，研究人员比较了野生型与ΔaspC菌株在最小培养基中的基因表达谱。结果显示，ΔaspC菌株中aspC表达显著降低，同时天冬氨酸转运蛋白dcuA显著上调，但天冬氨酸氨裂解酶aspA未受影响。此外，参与嘧啶合成的pyrB和氨基酸赖氨酸合成的lysC基因表达显著增加，而甲硫氨酸合成相关基因metL无变化。这表明aspC缺失改变了细菌的生理需求，增加了对天冬氨酸摄取及依赖天冬氨酸的生物分子合成的基因表达，但并未完全阻断这些合成途径。
AspC supports the central metabolism of S. Tm during anaerobic respiration
基于前述发现，研究人员假设AspC的作用可能与将天冬氨酸转化为草酰乙酸（oxaloacetate）以支持TCA循环有关。通过在含猪胃粘蛋白的培养基中添加延胡索酸（fumarate）、琥珀酸（succinate）或草酰乙酸等TCA中间体进行体外竞争实验，发现在有硝酸盐的条件下，添加这些中间体均能显著削弱野生型菌株对ΔaspC突变株的竞争优势。进一步的遗传学分析显示，缺失琥珀酸脱氢酶亚基A（sdhA）或柠檬酸合酶（gltA）能消除ΔaspC在有硝酸盐呼吸时的适应性缺陷，而缺失延胡索酸还原酶（frdABCD）则无此效果。这证实了AspC通过生成草酰乙酸来支持S. Tm在厌氧呼吸期间的氧化型TCA循环进程。
讨论与结论
本研究确立了天冬氨酸氨基转移酶AspC在鼠伤寒沙门氏菌于哺乳动物肠道内扩增中的作用。利用腹腔和经口感染途径，研究人员报道了在CBA/J小鼠模型中，AspC仅在肠道扩增期间是必需的，而在肝脏和脾脏等系统性部位则非必需。AspC对S. Tm肠道存活的必要性似乎独立于其主要毒力程序——两个III型分泌系统（T3SSs）。然而，丧失侵袭和细胞内复制能力显著增加了aspC缺陷菌株在早期感染时的缺陷，这表明S. Tm可能通过侵入肠上皮来规避健康肠道中的天冬氨酸饥饿初始反应。
研究结果表明，aspC的缺失导致了病原体代谢需求的改变，这一点通过qPCR、体外补充实验和关键TCA酶的基因失活得以确定。研究人员观察到，aspC的缺失导致与天冬氨酸输入及用于氨基酸和核苷酸合成相关的酶基因表达增加。然而，这些变化诱导程度有限，表明这些中枢代谢过程受到严格控制。相反，研究发现ΔaspC S. Tm在促进还原性分支链和氧化型TCA循环的体外条件下表现出显著的生长缺陷。因此，这提示了S. Tm ΔaspC在肠道扩增中出现缺陷的一个可能解释：该菌株无法利用胃肠炎期间肠道代谢环境的破坏所带来的优势。
最后，虽然研究人员未在支持厌氧呼吸的体外条件下观察到ΔaspC突变株在缺失frdABCD背景下的主要适应性缺陷，但不能排除延胡索酸还原酶FrdABCD在推动氧化型TCA循环向前运行中的作用，因为其表达在富含天冬氨酸和硝酸盐的厌氧生长条件下被诱导，这类似于病原体在炎症肠道中遇到的生长条件。未来的工作应旨在理清FrdABCD和SdhABCD在支持S. Tm在哺乳动物肠道中致病和扩增方面的关系。
总之，这些发现扩展了研究人员对S. Tm天冬氨酸代谢及其在不同器官部位存活影响的理解。未来的细菌代谢研究有望阐明致病细菌存活的未知方面，并为靶向这些必需代谢途径的治疗策略提供信息。该论文发表于《Infection and Immunity》。
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