张吕尧|张尧|孟环|张玉香|刘永东
中国科学院过程工程研究所生物制药制备与递送国家重点实验室，北京100190，中国
摘要
水痘-带状疱疹病毒（VZV）的糖蛋白E（gE）是开发亚单位疫苗的理想靶点。然而，在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的gE具有较高的制造成本和与糖基化相关的异质性。本研究将gE的胞外域（氨基酸25-539）表达在大肠杆菌中，获得了单体、未糖基化的gE胞外域（n-gE），并对其进行了全面表征。为了从包涵体中回收正确折叠的蛋白质，我们建立了一种两阶段重折叠策略：第一阶段在7 M尿素条件下促进二硫键的形成，第二阶段通过稀释至2 M尿素来恢复天然单体构象，重折叠效率高达90%。纯化的n-gE的二级和三级结构与CHO来源的糖蛋白E（CgE）高度相似。功能上，n-gE能够被VZV阳性血清识别，并且与针对gE的特异性中和单克隆抗体7H12的结合能力增强。在小鼠中的免疫实验表明，铝佐剂辅助的n-gE能够诱导强烈的gE特异性IgG反应和T细胞活化。这些结果表明，大肠杆菌来源的未糖基化gE是一种有前景且成本效益高的VZV亚单位疫苗候选抗原。
引言
水痘-带状疱疹病毒（VZV）在初次感染后会在感觉神经节中建立终生潜伏期，而随着年龄增长VZV特异性细胞免疫力的下降会导致带状疱疹（HZ）的发生。VZV包膜中的糖蛋白E（gE）是病毒复制、细胞间传播和免疫识别的关键成分。由于其免疫优势，gE被广泛用作HZ疫苗的主要靶抗原。
天然gE是一种高度糖基化的蛋白质，含有多个N-和O-连接糖基化位点，糖链约占全长gE分子质量的25%。因此，用于亚单位疫苗的gE胞外域通常在哺乳动物表达系统中生产，最常用的是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，以确保正确的折叠和翻译后修饰。值得注意的是，获批的带状疱疹亚单位疫苗Shingrix®中使用的重组gE抗原就是由CHO细胞生产的。然而，哺乳动物表达系统中的糖基化谱对培养条件非常敏感，经常导致结构异质性，从而影响产品的一致性和功能再现性。这种糖基化相关的变异性被认为是导致Fibroblast来源的Zostavax®疗效相对较低的原因之一，后者以过度的O-连接糖基化为特征。
酶解去糖基化后，大部分血清反应性仍然保留，表明抗体识别主要依赖于肽表位。与此观察结果一致的是，在大肠杆菌中表达的未糖基化gE片段（氨基酸31-358）仍具有显著的抗原性，说明原核表达可以在没有糖基化的情况下保留gE的关键抗原特性。因此，这种截短的gE构建体可能是一种具有商业吸引力的抗原解决方案。然而，有研究表明免疫优势T细胞表位分布在gE的整个544个氨基酸的胞外域中，这意味着在亚单位疫苗开发中可能需要包含完整的胞外域以增强免疫原性。基于此，制备与CHO来源的gE（CgE）相同的未糖基化gE（n-gE）对于基础研究和潜在应用都是必要的。然而，由于gE在细菌表达过程中容易形成二硫键并聚集，因此正确折叠的单体n-gE的生产在技术上具有挑战性。
本研究通过合理设计的两阶段重折叠策略，在大肠杆菌中成功制备了全长未糖基化的VZV gE胞外域。该方法依次进行二硫键形成和天然构象的恢复，从而实现了高产量的正确折叠单体n-gE的回收。随后对n-gE的结构完整性和抗原性质进行了表征，并在小鼠模型中评估了其免疫学性能。
实验部分
n-gE蛋白的表达
缺乏N端信号肽和跨膜区域（氨基酸25-539；UniProt: P09259）的VZV糖蛋白E胞外域使用pET-28a（+）质粒在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达。该构建体去除了信号肽区域的氨基酸1-24，同时保留了预测切割位点上游的氨基酸，以保留据报道的CD4+ T细胞表位（从氨基酸26开始）。蛋白质表达使用0.5 mM的诱导剂进行。在原核系统中的n-gE表达
与Shingrix®中使用的抗原相同胞外域的n-gE使用pET-28a（+）载体在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达。为了减少包涵体的形成，蛋白质表达在25 °C和18 °C以及标准条件37 °C下进行。SDS-PAGE分析显示，在三种温度下表达水平均较高，表观分子量约为58.3 kDa（图1a）。如预期，在37 °C下n-gE主要以包涵体形式存在。讨论
作为病毒复制和传播的核心决定因素，gE被广泛认为是HZ亚单位疫苗开发的主要靶抗原。然而，依赖哺乳动物表达系统生产gE会导致较高的制造成本和糖基化异质性。本研究采用逐步重折叠策略在大肠杆菌中高效生产了未糖基化的gE，并证实其具有结构和免疫学特性。
作者贡献声明
张吕尧：撰写初稿、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、数据整理。张尧：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法设计、概念构思。孟环：数据可视化、软件处理。张玉香：数据可视化、软件使用、方法设计。刘永东：撰写、审稿与编辑、项目管理、资源获取、项目协调、资金申请、概念构思致谢
本工作得到了北京市科学技术委员会和中关村科技园区管理委员会联合支持的北京海淀重点项目（项目编号L202001）的资助。感谢王连燕博士提供VZV阳性小鼠血清和CHO来源的糖蛋白E。
