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帕金森病（PD）是一个重大的全球健康挑战，其发病受环境因素和α-突触核蛋白的积累影响。微小RNA（miRNAs）作为基因表达的关键调节因子，在神经退行性病变中起着关键作用，而它们的失调与PD的发展有关。百草枯（PQ）是一种广泛使用的除草剂，可以通过产生活性氧、损害线粒体功能、促进α-突触核蛋白聚集以及触发多巴胺能神经元的凋亡来诱发类似PD的症状。这些效应最终会改变miRNA的表达谱。我们之前的研究表明，一种基于计算机设计的蛇毒启发肽——十七肽（HNP）能够在体外（大鼠PC-12细胞）和体内（秀丽隐杆线虫）中保护细胞免受PQ诱导的毒性和神经退行性病变的影响。在这项研究中，使用小鼠2.5S神经生长因子（NGF）或HNP处理秀丽隐杆线虫后进行的miRNA微阵列分析显示，与对照组相比，cel-miR-1–3p、cel-miR-255–3p、cel-miR-62、cel-miR-358–3p和cel-miR-1820–5p的表达显著上调。通路分析表明这些miRNA参与了神经保护信号通路，包括PI3K、Wnt/β-连环蛋白和TGF-β通路，而下调的miRNA则与凋亡、p53和先天免疫通路相关，这强调了HNP通过调节miRNA在秀丽隐杆线虫中的神经保护作用。此外，我们从上述五个上调的miRNA中选择了31个预测的目标基因，这些基因参与基因调控、抑制促炎细胞因子、线粒体代谢和跨膜运输。qRT-PCR分析显示，PQ处理后这些基因的表达趋势降低，而HNP预处理显著恢复了它们的表达；然而，NGF预处理与对照组相比没有显著变化。比较miRNA谱分析表明，NGF/HNP恢复了PQ引起的改变，其中HNP通过显著上调miR-4813–3p增强了α-突触核蛋白的清除。这些发现使HNP成为针对PD及相关疾病进行miRNA靶向干预的有希望的候选物。
1. 引言
神经退行性疾病（NDs），如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和亨廷顿病，其特征是神经元死亡和认知功能的不可逆丧失。(1,2) 这些疾病表现为异常蛋白质聚集，例如AD中的β-淀粉样蛋白（Aβ）和PD中的α-突触核蛋白。(3) 关于新型治疗分子的研究以减缓或阻止NDs进展正受到广泛关注。(4−6) 神经营养因子（如神经生长因子（NGF）对神经元存活和维持至关重要，而神经营养因子的减少会促进NDs的发病机制。(7,8) 然而，由于药代动力学不佳，使用外源性NF的临床试验大多失败了。(7,8) 微小RNA（miRNAs）是小型非编码RNA，通过靶向特定基因来调节多种生物功能，包括衰老、增殖、分化、凋亡、炎症和神经退行性病变。(9) miRNA表达的改变与多种疾病有关，包括NDs。(9−13) 1993年，Lee等人首次报道了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中调节衰老过程的miRNA lin-4。(14) 自那时起，C. elegans被用作研究与神经元发育及其靶基因相关的miRNAs的模型系统。(15−17) C. elegans因其保守的miRNAs、已知的神经网络和神经解剖结构而成为研究与神经元发育相关的miRNAs的理想模型。(9) 此外，它对于理解miRNAs在神经生物学中的作用及其与医学意义相关的功能障碍具有重要意义。
暴露于神经毒性污染物（如百草枯（PQ）会增加类似PD的病理风险。(18) PQ是一种线粒体毒性除草剂，在农业中广泛使用，并用于研究PD的发病机制和神经保护治疗。(19,20) 以往的研究报告了在不同C. elegans突变模型或重金属或纳米材料毒性作用下miRNAs的失调。(21−23) 然而，神经肽或天然化合物对农药毒性的保护作用以及神经营养因子或其类似物对C. elegans整体miRNA表达的影响尚未得到充分记录。考虑到这些优势，本研究使用C. elegans作为miRNA下一代测序分析的模型系统。
神经突触发生（neuritogenesis）是指神经元发展其特征性神经突起（轴突和树突）网络的过程，该过程受涉及细胞骨架重组、膜添加以及MAPK/ERK和PI3K/Akt/mTOR等蛋白质协调的复杂通路调控。(24) 这些通路促进神经突起的形成、稳定和延长，对神经元连接性和功能至关重要。增强的神经突触发生有助于神经元在损伤或毒性刺激下的存活和突触可塑性。(24) PQ主要通过氧化还原循环引起神经毒性，导致多巴胺能神经元氧化应激、线粒体功能障碍，最终导致细胞死亡，从而促进帕金森病病理。能够增强神经突触发生的肽可以通过加强细胞骨架完整性、促进轴突生长、减少氧化应激和调节细胞存活通路来对抗这种毒性。(25,26) 两种基于计算机设计的蛇毒启发肽[十三肽（TNP）和十七肽（HNP）在体外大鼠嗜铬细胞瘤细胞系（PC-12细胞）和体内C. elegans模型中显示出预防PQ诱导的毒性和神经退行性病变的神经保护作用。(27,28) 因此，TNP和HNP观察到的神经保护作用是通过抗氧化防御激活、线粒体保护和促进神经突起生长来实现的，从而减轻PQ引起的神经退行性病变。然而，在两种模型中，HNP显示出略更好的神经保护活性。
基于我们之前关于合成肽神经保护能力的研究，我们旨在探讨C. elegans模型中PQ诱导的PD背景下与神经保护相关的miRNA表达谱。本研究检查了HNP调控的miRNAs及其激活类似小鼠2.5S-NGF（阳性对照）影响的信号通路的能力，强调了HNP在PQ相关情况下的神经营养和神经保护作用，并首次报告了C. elegans中NGF调控的miRNAs。
2. 结果
2.1. 通过miRNA微阵列分析确定C. elegans中受小鼠2.5S-NGF/定制肽（HNP）调控的miRNAs
miRNA微阵列分析显示，在NGF处理的C. elegans组中20个miRNAs的表达模式有所不同，如表1所示。具体来说，10个miRNAs的表达上调，而10个下调。同样，在HNP处理的C. elegans组中也有13个miRNAs的表达差异（表2），其中10个miRNAs上调，3个下调。值得注意的是，包括cel-miR-255–3p、cel-miR-1–3p、cel-miR-62、cel-miR-85–3p、cel-miR-71–3p、cel-miR-83–3p、cel-miR-84–5p和cel-miR-4936在内的几个miRNAs在NGF和HNP处理组中均有表达。与对照组相比，cel-miR-1–3p和cel-miR-255–3p在NGF和HNP组中均显著上调。此外，表3列出了在NGF和HNP处理组中鉴定出的潜在miRNA靶标相关的通路。这些发现强调了miRNAs在C. elegans中通过NGF和HNP处理促进神经突起生长和神经保护中的多种调控作用。
表1. miRNA微阵列分析数据，显示用50 μg/mL（相当于1.89 μM）小鼠2.5S-NGF处理2小时的C. elegans组与对照组（CT组）相比差异表达的miRNAs的倍数变化，统计显著性p < 0.05
| miRNA类型 | logFC (CT vs NGF) | t值 | p值 |
| --- | --- | --- | --- |
| cel-miR-1–3p | 2.69 | 35 | 4.70 | 0.00 |
| cel-miR-255–3p | 2.21 | 4.48 | 0.01 |
| cel-miR-83–3p | 1.93 | 8.21 | 0.00 |
| cel-miR-85–3p | 1.92 | 74.28 | 0.00 |
| cel-miR-59–3p | 1.87 | 20 | 6.60 | 0.00 |
| cel-miR-62 | 1.72 | 5.10 | 0.01 |
| cel-miR-84–5p | 1.60 | 32 | 8.20 | 0.00 |
| cel-miR-794–5p | 1.54 | 9.79 | 0.00 |
| cel-miR-795–3p | 1.51 | 3.19 | 0.03 |
| cel-miR-71–3p | 1.30 | 7.72 | 0.00 |
| cel-miR-4936–3.08 | –14 | 6.30 | 0.00 |
| cel-miR-67–3p | –3.14 | –12.97 | 0.00 |
| cel-miR-41–5p | –3.27 | –5.73 | 0.00 |
| cel-miR-554 | 5–3p | –3.33 | –5.08 | 0.01 |
| cel-miR-82 | 11–5p | –3.79 | –5.45 | 0.00 |
| cel-miR-820 | 4–5p | –3.88 | –10.46 | 0.00 |
| cel-miR-67–5p | –4.12 | –5.04 | 0.01 |
| cel-miR-820 | 5–3p | –4.81 | –12.01 | 0.00 |
| cel-miR-22 | 17b-3p | –5.04 | –4.68 | 0.01 |
| cel-miR-820 | 2–5p | –5.10 | –4.23 | 0.01 |
表2. miRNA微阵列分析数据，显示用50 μg/mL（相当于35.7 μM）定制肽（HNP）处理2小时的C. elegans组与对照组（CT组）相比差异表达的miRNAs的倍数变化，统计显著性p < 0.05
| miRNA类型 | logFC (CT vs HNP) | t值 | p值 |
| --- | --- | --- | --- |
| cel-miR-255–3p | 3.47 | 2.39 | 0.02 |
| cel-miR-87–5p | 3.13 | 2.09 | 0.04 |
| cel-miR-1–3p | 1.87 | 18.95 | 0.00 |
| cel-miR-1820–5p | 1.54 | 16.87 | 0.00 |
| cel-miR-62 | 1.53 | 2.11 | 0.03 |
| cel-miR-358–3p | 1.50 | 2.45 | 0.01 |
| cel-miR-85–3p | 1.38 | 14.25 | 0.00 |
| cel-miR-71–3p | 1.30 | 4.91 | 0.00 |
| cel-miR-83–3p | 1.40 | 11.42 | 0.00 |
| cel-miR-84–5p | 1.55 | 7.65 | 0.00 |
| cel-miR-791–3p | –1.36 | –7.17 | 0.00 |
| cel-miR-789–5p | –1.44 | –2.55 | 0.01 |
| cel-miR-4936 | –1.55 | –13.84 | 0.00 |
表3. HNP和小鼠2.5S-NGF处理的C. elegans中潜在miRNA靶基因的通路注释
| HNP处理的C. elegans的p值 | 小鼠2.5S-NGF处理的C. elegans的p值 |
| --- | --- | --- |
| BINDING: ATP | 0.46 | 3 |
| CARBOHYD: N-linked (GlcNAc) asparagine | 0.18 | 3 |
| 01100: 代谢通路 | 0.00 | 0 |
| 01200: 碳代谢 | 0.00 | 6 |
| 004 | 0.00 | 1 |
| 01230: 氨基酸生物合成 | 0.00 | 1 |
| GO:0000166 | 纳苷酸结合 | 0.29 | 9 |
| GO:0000287 | 镁离子结合 | 0.00 | 9 |
| GO:000488 | 跨膜信号受体活性 | 0.25 | 5 |
| GO:0005216 | 离子通道活性 | 0.36 | 7 |
| GO:0005230 | 细胞外配体门控离子通道活性 | 0.24 | 9 |
| GO:0005524 | ATP结合 | 0.42 | 5 |
| GO:0005739 | 线粒体 | 0.02 | 4 |
| GO:0005886 | 细胞膜 | 0.22 | 6 |
| GO:0006811 | 离子运输 | 0.05 | 5 |
| GO:0006813 | 钾离子运输 | 0.06 | 9 |
| GO:0006937 | 肌肉收缩调节 | 0.03 | 2 |
| GO:0007165 | 信号转导 | 0.07 | 0 |
| GO:0007268 | 化学突触传递 | 0.34 | 8 |
| KW-0407 | 离子通道 | 0.48 | 1 |
| GO:0016301 | 激酶活性 | 0.19 | 8 |
| KW-0460 | 镁 | 0.20 | 7 |
| GO:0016310 | 磷酸化 | 0.18 | 6 |
| GO:0022848 | 乙酰胆碱门控阳离子选择性通道活性 | 0.01 | 7 |
| GO:0022857 | 跨膜转运蛋白活性 | 0.27 | 8 |
| GO:0030054 | 细胞连接 | 0.16 | 5 |
| GO:0030594 | 神经递质受体活性 | 0.28 | 6 |
| GO:0042391 | 膜电位调节 | 0.24 | 1 |
| GO:0043005 | 神经元投射 | 0.25 | 4 |
| GO:0045211 | 突触后膜 | 0.06 | 3 |
| GO:004666 | 卵巢位置调节 | 0.05 | 6 |
| GO:0050877 | 神经系统过程 | 0.22 | 6 |
| GO:0055085 | 跨膜运输 | 0.42 | 4 |
| GO:0060078 | 突触后膜电位调节 | 0.00 | 2 |
| GO:0060079 | 兴奋性突触后电位 | 0.02 | 1 |
| GO:0090326 | 与运动行为相关的正向运动调节 | 0.01 | 4 |
| IPR002394: 尼古丁乙酰胆碱受体 | 0.00 | 9 |
| IPR006029: 神经递质门控离子通道跨膜结构域 | 0.11 | 8 |
| IPR006201: 神经递质门控离子通道 | 0.17 | 2 |
| IPR006202: 神经递质门控离子通道配体结合 | 0.17 | miRNA测序分析数据：比较不同处理组中miRNA差异表达的倍数变化
amiRNAlog FC (CT vs PQ)
logFC (PNGF vs PQ)
功能
参考文献
cel-miR-77–5p–3.17
1.32
胚胎发生
Abbott, 2012
cel-miR-48
13–3p–3.05
3.65
α-突触核蛋白的降解
Sarkar等人，2022
cel-miR-34–3p–1.95
1.58
增强自噬通量以对抗氧化应激
Yang等人，2013
cel-miR-236–3p–1.39
2.80
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路促进细胞生长和发育（延长寿命）
Lencastre等人，2010
cel-miR-46–3p–1.09
1.36
发育
Lau等人，2001
cel-miR-78
6–3p
1.39–1.16
脂肪酸代谢
Kemp等人，2012
cel-miR-18
20–5p
1.43–1.54
先天免疫反应
Sun等人，2016
cel-miR-83–3p
1.75
1.35
miR-83的丢失可延长寿命
Dzakah等人，2018
cel-miR-79
5–3p
2.17–1.44
Dauer形成
Martinez等人，2008
实验条件在文本中有所描述。
表5. miRNA测序分析数据：比较不同处理组中miRNA差异表达的倍数变化
amiRNAlogFC (CT vs PQ)
logFC (PHNP vs PQ)
功能
参考文献
cel-miR-77–5p–3.17
1.18
胚胎发生
Abbott, 2012
cel-miR-62–3.00
3.82
调节应激反应并延长寿命
Lencastre等人，2010
cel-miR-48
13–3p–3.05
1.20
α-突触核蛋白的降解
Sarkar等人，2022
cel-miR-49
36–2.59
1.57
激活热休克因子-1（HSF-1）以保护细胞免受细胞器功能障碍
Schreiner，2019
cel-miR-236–3p–1.39
1.77
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路促进细胞生长和发育（延长寿命）
Lencastre等人，2010
cel-miR-83–3p
1.75
1.03
miR-83的丢失可延长寿命
Dzakah等人，2018
cel-miR-57–3p
3.23–2.38
cel-miR-82
07–3p
4.31–7.62
实验条件在文本中有所描述。
图2. 不同处理组中秀丽隐杆线虫（C. elegans）miRNA的差异表达。
(a–c) PCA得分图显示了不同处理组之间以及生物重复样本内的基因表达变异性。
(d–f) 相关性图显示了处理组之间的相关性。
(g) 火山图（p值与log Fc的关系）用于比较PNGF组和PQ组；
(h) 火山图（p值与log Fc的关系）用于比较PHNP组和PQ组。
CT：未处理的线虫；PQ：经PQ处理的线虫；PHNP：先经HNP肽预处理后经PQ处理的线虫；NGF：先经2.5S-NGF预处理后经PQ处理的线虫。
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火山图（p值与倍数变化）显示了PNGF组和PQ组（图2g）以及PHNP组和PQ组（图2h）之间miRNA的差异表达。热图分析比较了不同处理组之间的miRNA表达谱（图3a,b）。分析显示，PQ处理组中上调的miRNA在PNGF组和PHNP组中下调；相反，PQ处理组中下调的miRNA在PNGF组和PHNP组中上调。这种反向关系表明，NGF和HNP的预处理调节了miRNA表达谱，使其恢复到对抗PQ暴露引起的改变的状态。这些发现表明，这些处理可能恢复了或规范了被PQ破坏的miRNA表达，从而可能具有神经保护作用。基因网络分析确定了miRNA的下游mRNA靶标，这些靶标调节多种蛋白质类（表6）。该表列出了PNGF组和PHNP组中miRNA的下游mRNA靶标，并按Panther蛋白质类别进行了分类。预测的靶标包括对各种细胞过程至关重要的多种蛋白质功能，如离子通道、跨膜信号受体、RNA代谢蛋白、酰基转移酶、载脂蛋白、DNA导向的RNA聚合酶、伴侣蛋白、过氧化物酶等。这些蛋白质参与关键的生物功能，包括转录调控、细胞发育、信号转导和代谢途径。PNGF组和PHNP组的详细miRNA和靶标mRNA网络分别显示在图4a,b中，突出了这些实验模型中神经保护机制背后的复杂调控相互作用。
表6. 选定靶基因miR-1-3p、miR-255-3p、miR-62、miR-358-3p、miR-1820-5p和miR-4813-3p的来源：miRnet；基因（miRTarBase版本9.0），参考：Caenorhabditis elegans-WormBase
编码的基因：
involved in...
3. 讨论
由于目前没有有效的治疗方法可以阻止神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）的进展，这些疾病近年来已成为神经生物学中的重大问题，因此人们正在加大研究力度，以开发创新的神经保护疗法。miRNA在神经退行性疾病中的潜在作用促进了新治疗靶点的发现。由于神经营养因子无法穿过血脑屏障（BBB），必须通过脑内给药，因此它们在治疗中枢神经系统功能障碍方面的应用更加复杂。然而，小分子合成肽可以作为治疗神经疾病的一种替代方法，与大型蛋白质分子相比具有多个优势。(32) 某些名为MIM-D3（TrkA激动剂）的肽可以改善患有干眼症的大鼠的角膜损伤。(33) 同样，GK-2（NGF模拟物）在不产生不良反应的情况下改善了阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和脑缺血等神经系统疾病。(34,35) 如秀丽隐杆线虫（C. elegans）这样的体内模型生物为阐明miRNAs在神经元发育和功能中的作用和机制提供了宝贵的平台。(9) 以往的研究强调了cel-miR-71、cel-miR-84和cel-miR-1在神经元发育各个阶段的参与。(9) 我们的研究发现，在接受NGF和HNP处理的秀丽隐杆线虫组中，这些miRNAs的表达显著上调。这些发现突显了HNP的神经修复和神经营养潜力，其效果似乎与小鼠2.5 S-NGF相当。在秀丽隐杆线虫中，经过小鼠2.5 S-NGF和定制肽HNP处理后，cel-miR-1–3p、cel-miR-255–3p和cel-miR-62的表达水平显著升高。然而，经过肽HNP处理后，cel-miR-358–3p和cel-miR-1820–5p的表达水平显著升高，而在NGF处理后则没有观察到显著变化。本研究检测了cel-miR-1–3p的靶基因，包括F49C12.12、C28H8.3、K08D12.3、K10D3.4、F35H10.10和C48B6.10等（表6）。这些靶基因与基因调控、RNA代谢、G蛋白偶联信号传导、蛋白质稳定性和免疫调控相关（miRnet, WormBase ParaSite, C. elegans）。在秀丽隐杆线虫的帕金森病模型中，基因调控和RNA代谢途径在应激条件下对神经元存活起着关键作用。(36) G蛋白偶联信号传导调节突触功能和神经元通信，影响帕金森病的表型。蛋白质稳定性机制，包括泛素-蛋白酶体活性，有助于维持细胞蛋白质稳态并减少神经毒性。(37) 免疫相关途径调节类似神经炎症的反应，影响神经退行性病变的进展。(38) 这些途径定义了影响秀丽隐杆线虫帕金森病进展的复杂分子景观。cel-miR-255–3p同样调节包括suca-1、kcnl-2、idhb-1、tos-1、F49C12.12和C37C3.2在内的基因（表3b）。这种调节影响与线粒体代谢、蛋白质合成、膜运输和分选以及跨膜转运蛋白活性相关的途径（miRnet, C. elegans─WormBase ParaSite; https://parasite.wormbase.org/Caenorhabditis_elegans_prjna13758/Info/Index/）。线粒体代谢紊乱在秀丽隐杆线虫的帕金森病模型中起关键作用，通过诱导线粒体片段化和能量产生受损，导致多巴胺能神经元退化。(39) 蛋白质合成的改变影响神经退行过程中的蛋白质稳态和细胞应激反应。(36) 膜运输和分选缺陷会损害突触囊泡的回收和神经元通信。(40) 跨膜转运蛋白活性的变化影响离子稳态和解毒，加剧帕金森病模型中的神经元损伤。(41) cel-miR-62调节参与信号转导、细胞调控、镁离子稳态、蛋白质泛素化和应激反应的基因，这些都是维持神经元功能所必需的。cel-miR-358–3p和cel-miR-1820–5p的靶基因调控细胞增殖、分化、mRNA稳定性、翻译和转录后调控以及囊泡运输和Rab效应介导的膜运输。值得注意的是，蛋白质泛素化和通过泛素-蛋白酶体系统的调控性降解，以及信号转导和囊泡运输机制，对于防止这些帕金森病模型中的神经退行性病变至关重要。这些途径的紊乱与神经退行性疾病的发病和发展有关。值得注意的是，暴露于PQ的秀丽隐杆线虫表现出与特定miRNAs相关的靶基因表达减少的趋势。HNP预处理显著增加了这些基因的相对表达（图5–9）。这些发现增强了我们对miRNAs如何影响神经退行性疾病发展和进展的关键途径的理解，并可能为开发治疗策略提供有价值的见解。我们认识到，尽管这些结果具有提示性，但直接验证miRNA-靶基因相互作用（如荧光素酶报告基因检测或CRISPR敲低）仍然是确认这些miRNAs在α-突触核蛋白清除和神经保护中的具体调控作用的关键下一步。p38/MAPK信号通路在神经元分化中起着关键作用，我们实验室之前的研究已经证明了这一点（42−44），该研究显示小鼠2.5 S-NGF可以诱导这一过程。本研究中使用的定制肽也来源于蛇毒NGF的TrkA结合区域，同样促进神经元分化和生长。(27,28) 我们的发现表明，与小鼠2.5 S-NGF类似，HNP上调了cel-miR-1–3p，调节p38/MAPK通路以促进秀丽隐杆线虫的神经元分化。与我们之前的转录组学、蛋白质组学和qRT-PCR结果一致，当前的微阵列和miRNA分析进一步证实了HNP在调节神经保护关键信号通路中的作用。我们之前的研究表明，HNP预处理上调了抗氧化剂（sod、gst、trx、cat）和热休克蛋白基因（hsp-16.1、hsp-16.2），同时下调了凋亡基因（ced-3、egl-1、cyt c）和MAPK通路调节因子（skn-1、sek-1、pmk-1）。在我们之前的研究中还包括了一个 scrambled肽（阴性对照），它没有显示出神经保护作用，从而证实了HNP介导的反应的特异性。这些分子变化伴随着线粒体膜电位的恢复、ROS生成的减少以及秀丽隐杆线虫神经元存活率的提高。本研究通过揭示HNP还调节与PI3K/Akt、Wnt/β-连环蛋白和TGF-β信号通路相关的miRNAs和转录本，进一步扩展了这些观察结果，表明这种协调的转录和转录后调控共同减轻了氧化应激、凋亡和炎症。α-突触核蛋白的积累是帕金森病进展的标志（45）。去除这种蛋白质的聚集是改善帕金森病所必需的机制。研究表明，cel-miR-4813–3p是参与神经元细胞中α-突触核蛋白清除的蛋白质稳态调节因子。(21,22) miR-4813–3p通过靶向自噬体-溶酶体和泛素-蛋白酶体降解途径中的关键基因，成为这一过程的关键调节因子。(21) 在秀丽隐杆线虫中的定量实时PCR分析表明，百草枯暴露减少了gbf-1、vha-5、cup-5和cpd-2的表达，表明在氧化应激下蛋白质稳态受损。用神经保护肽HNP和NGF预处理可以恢复这些基因的表达，其中HNP特别增强了cpd-2的表达，而NGF独特地上调了acs-1的表达。这种差异性调节突显了这些靶基因在自噬、氧化应激防御、运动功能和凋亡调节中的多方面作用，这些对于维持神经元健康至关重要。HNP处理的线虫中vha-5、cup-5和cpd-2的更大上调进一步支持了该肽在修复帕金森病相关分子缺陷中的强大作用。我们的实验室已经证明了HNP的神经保护潜力（27,28），在本研究中，我们发现PQ处理的秀丽隐杆线虫中cel-miR-4813–3p的表达下调，导致α-突触核蛋白沉积和帕金森病的进展。值得注意的是，PHNP和PNGF组中cel-miR-4813–3p的上调强烈表明这些肽通过miRNA调节具有治疗潜力。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路促进寿命和神经元发育，并受cel-miR-236–3p的调控。(46) PQ处理下调了cel-miR-236–3p的表达，而在PHNP和PNGF组中其上调支持了HNP通过miRNA调节的神经保护作用。此外，两种新的miRNAs，cel-miR-8207–3p和cel-miR-57–3p，在PQ处理中上调，在小鼠2.5 S-NGF和HNP预处理中下调。这些miRNAs的功能尚不清楚，需要进一步探索。我们的研究阐明了HNP如何影响神经元分化，减轻帕金森病模型中的α-突触核蛋白聚集，并通过miRNA介导的通路促进神经保护。尽管秀丽隐杆线虫为研究保守的信号通路和miRNA介导的神经元发育及应激反应提供了极好的模型，但它向哺乳动物系统的转化存在固有的局限性。这些局限性包括神经元复杂性的差异、缺乏血脑屏障（BBB）以及miRNA保守性的差异。因此，在哺乳动物系统中进一步验证对于确认HNP的治疗相关性至关重要。虽然我们的研究表明HNP调节特定的miRNAs并在秀丽隐杆线虫中提供神经保护，但我们认识到这些发现仍处于临床前和探索阶段。直接将其外推到人类帕金森病需要谨慎，因为线虫模型无法完全再现哺乳动物帕金森病的复杂性，包括复杂的运动症状和α-突触核蛋白聚集。此外，尽管我们发现了与HNP处理相关的miRNA变化，但并未进行miRNA-靶基因相互作用的直接实验验证（例如，荧光素酶报告基因检测或敲低和过表达研究）。未来在哺乳动物系统中的研究，结合强有力的机制验证，对于确认HNP作为神经保护剂的有效性至关重要。现在明确指出这些局限性，以确保对我们发现的平衡解释。4. 结论总之，本研究表明，PQ诱导的秀丽隐杆线虫miRNA表达变化与发育过程、寿命调节、α-突触核蛋白降解和氧化应激反应的紊乱有关，这些都是神经退行性疾病（NDs）发病机制的关键因素。与凋亡通路相关的miRNAs上调、寿命缩短、先天免疫反应减弱和代谢失调进一步表明它们在促进NDs进展中的作用。小鼠2.5 S-NGF和定制肽HNP的预处理有效恢复了PQ处理诱导的失调miRNAs的表达，突显了它们作为神经保护策略的潜力。这些发现强调了针对miRNA介导通路的神经保护作用在NDs中的治疗前景，为开发针对疾病进展的靶向疗法提供了新的途径。5. 材料与方法5.1. 材料和试剂S Biochem（印度喀拉拉邦Thrissur）合成了一种定制肽HNP（NH2-HGGKGIGKGGTGGAGVG-COOH）。小鼠2.5 S-NGF购自Sigma-Aldrich（美国）。RNeasy Plant Mini Kit购自Qiagen，DNase I（无RNase）购自New England Biolabs（NEB）（目录号M0303L kit）。qRT-PCR分析所需的引物购自Thermo Fisher Scientific（前身为Molbiogen）。所有化学品均为分析级，来源包括Sigma、Merck、Hi-Media、Invitrogen和Thermo Fisher Scientific USA。秀丽隐杆线虫Bristol野生型菌株N2和细菌对照E. coli（OP50）购自美国明尼苏达大学Caenorhabditis Genetics Centre（CGC）。5.2. 秀丽隐杆线虫菌株的维持使用野生型Bristol菌株N2作为体内模型，以确定PQ诱导的氧化应激及其通过定制肽的逆转。秀丽隐杆线虫N2菌株在20°C的生物培养箱中培养于nematode生长培养基（NGM）平板上。NGM和E. coli菌株OP50作为食物来源。同步化使用Campbell和Zuryn（2024）描述的标准碱式次氯酸盐方法进行，但作了一些修改。(41) 含有足够卵子的NGM平板用M9缓冲液清洗后收集到15 mL锥形离心管中。向含有线虫的15 mL管中加入1 mL次氯酸钠和5 N NaOH（0.5 mL），然后在3.5 mL M9缓冲液中搅拌2分钟，并在室温下以7500 rpm离心以沉淀卵子。弃去上清液，用M9缓冲液洗涤沉淀物两次。然后向沉淀物中加入0.1 mL M9缓冲液，将其转移到未播种的NGM平板上，并在加入E. coli OP50后于20°C孵育。5.3. miRNA测序以研究全球miRNA表达谱并比较PQ组和PHNP组的秀丽隐杆线虫为了这项研究，我们选择了基于之前工作的优化剂量。(28) 在那项研究中，浓度为50 μg/mL的肽HNP对PQ诱导的帕金森病病理表现出最佳的神经保护效果。基于秀丽隐杆线虫的初步剂量-反应实验，确定了HNP的最佳剂量（50 μg/mL），测试的浓度范围从10到100 μg/mL。在50 μg/mL时观察到最大的神经保护效果，包括趋化行为、多巴胺能神经元完整性和存活率的恢复。较低浓度提供了部分保护，而较高浓度则没有额外的好处。这一剂量也与我们之前的体内研究（28）一致，并且没有检测到毒性。同步化的L4期野生型N2秀丽隐杆线虫在20°C下接受以下处理：(a) 1X PBS处理的线虫（CT组），(b) 10 mM PQ处理1小时（PQ组），(c) 50 μg/mL（相当于35.7 μM）定制肽（HNP）预处理2小时，然后与10 mM百草枯（LC50值）孵育1小时（PHNP组），(d) 50 μg/mL（相当于35.7 μM）HNP处理2小时（HNP组），(e) 50 μg/mL（相当于1.89 μM）小鼠2.5 S-NGF预处理2小时，然后与10 mM百草枯孵育1小时（PNGF组），(f) 50 μg/mL（相当于1.89 μM）小鼠2.5 S-NGF处理2小时（NGF组）。每个处理组最初包含250-300条线虫，研究中总共使用了大约1500-1800条线虫。5.3.1 总RNA提取 使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）进行总RNA提取。提取的RNA按照制造商的协议（NEB）进行了DNase处理。RNA浓度和质量通过Qubit荧光计进行测量，RNA完整性通过Agilent BioAnalyzer进行分析。只有RIN值≥7的样本被用于RNA文库的制备。5.3.2 RNA文库制备和测序 根据制造商的协议，使用QIAseq miRNA Library Kit制备转录组mRNA文库。合格的RNA样本经过poly-A捕获或核糖去除处理，随后进行RNA片段化、3′连接、5′连接、cDNA纯化、接头和条形码连接、大小选择和扩增。文库的定量使用Qubit和BioAnalyser（Agilent）完成。测序工作在印度班加罗尔的Biokart India Pvt Ltd.的Illumina 150 bp PE平台上进行。5.3.3 数据处理和分析 从文库中生成的所有读段都使用FastQC（v0.11.8）进行了质量控制，并使用Trim Galore（v0.6.7）去除了低质量读段和接头。使用Trinity（v2.13.2）进行了从头转录组组装。通过CD-HIT和基于期望最大化的RNA-Seq（RSEM）验证了主要组装并去除了冗余部分。验证后的转录本使用Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery（DAVID）进行了基因本体分析。原始读段计数使用RSEM（v1.3.3）、STAR（v2.7.10a）或Salmon（v1.6.0）获得，并使用BAM和SAM（v1.14）工具以及Picard（v2.18.7）进行处理。比较分析使用Interactive Gene Expression Analysis Kit for Microarray & RNA-seq Data（iGEAK）（v1.0a）进行，这是一个基于R（v3.3.2）和JavaScript的开源桌面应用程序，与Shiny平台集成。通过Voom/edgeR/limma分析识别差异表达基因（DEGs）。为了控制多重比较产生的假阳性结果，应用了Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）方法，调整后的p值<0.05的miRNAs/基因被认为是显著的。MiRTarBase预测了miRNAs的目标基因，并通过Panther数据库分析了它们的功能。数据生成和分析在印度班加罗尔的Biokart India Pvt Ltd.完成。5.3.4 qRT-PCR分析 以确定用定制肽（HNP）预处理秀丽隐杆线虫（C. elegans）对百草枯诱导的miRNA-目标基因表达的影响 使用miRNA-target interaction数据库miRnet（miRTarBase版本9.0）（https://www.mirnet.ca/upload/MirUploadView.xhtml）识别了cel-miR-1–3p、cel-miR-255–3p、cel-miR-62、cel-miR-358–3p和cel-miR-1820–5p的miRNA目标基因。cel-miR-4813–3p的目标基因也是通过该方法识别的。另外，收集了大约400-500条L4阶段的成年线虫并放入1.5 mL的离心管中。收集的线虫经过多次洗涤以去除表面的残留细菌。洗涤后，样本进行离心，上清液被小心丢弃。然后将线虫沉淀重新悬浮在含有50 μg/mL（相当于35.7 μM）定制肽HNP和50 μg/mL（相当于1.89 μM）NGF的1× PBS中。悬浮液在50 rpm的试管旋转器中搅拌2小时，以确保线虫充分接触肽和NGF。沉淀重新悬浮在含有10 mM PQ的1× PBS中，并在20°C下孵育1小时以诱导氧化应激。百草枯处理后，线虫再次洗涤以去除残留的化学物质。根据制造商的协议，使用Invitrogen RNA分离试剂盒从线虫中提取RNA。通过比较260 nm和280 nm处的吸光度比值，使用nanodrop仪器对提取的RNA的含量和纯度进行了光谱评估。为了进行下游的基因表达研究，根据（25）中描述的方法从RNA生成互补DNA（cDNA）。所得cDNA被稀释后，使用SYBR Green master mix（Biorad）进行了实时PCR。qRT-PCR使用的引物序列列在表S7中。这些基因的表达相对于act-1内参基因使用2–ΔΔCt技术进行测量。每个实验条件独立重复三次，以确认结果的可靠性和重复性。5.3.5 miRNA测序数据的统计分析和标准化 miRNA表达的倍数变化是通过平均对照组的读段并针对每个处理组将每个miRNA相对于对照组进行标准化后转换为log2值来计算的。没有读段的miRNAs被排除在后续分析之外。统计分析，包括标准化（edgeR或voom/limma）和DEGs的识别，使用iGEAK（v1.0a）进行，这是一个基于R和Java的应用程序。差异表达分析的调整后P值在支持信息中提供。分析标准包括FDR阈值[指定阈值，例如0.05]和倍数变化截止值[指定截止值，例如2倍]。5.3.6 样本量计算 本研究没有使用正式的统计方法来预先确定样本量。本研究中使用的受试者数量是基于类似性质的前期研究确定的，以确保足够的统计功效和有效性（27−29,47,48）。样本量的确定遵循该领域的标准实践，以确保结果的稳健性和可重复性。
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