摘要
纤维素酶和半纤维素酶属于水解酶类（EC 3.2），在木质纤维素生物质的降解过程中起着关键作用，具有广泛的工业应用价值。随着对更高效、更具经济可行性的生物技术工艺需求的增长，人们开始探索能够在恶劣工艺条件下表现出更强鲁棒性的新酶产生微生物。本研究通过固态发酵利用小麦麸皮作为底物，研究了Aureobasidium leucospermi LB86酵母产生纤维素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和β-木酮糖苷酶的能力，并对发酵提取物的功能进行了表征。实验发现，在略酸性的pH条件（5.0至6.5范围内）下酶活性最高。纤维素酶和木聚糖酶在50–55°C时表现出最佳活性，而β-葡萄糖苷酶和β-木酮糖苷酶则在40°C时达到最大活性。这些酶在评估的温度范围内经过热处理后仍能保持显著的活性。β-葡萄糖苷酶和β-木酮糖苷酶对葡萄糖、木糖和阿拉伯糖具有中等程度的耐受性，在浓度高达0.5 M时仍能保持60%以上的残留活性。10%（v/v）乙醇的存在对β-葡萄糖苷酶的活性没有影响，无论是在其最佳pH值下还是在pH 5.0的情况下。该酶提取物对大多数生物质预处理产生的化合物具有耐受性，但没食子酸和单宁酸除外。
引言
来自农业活动的木质纤维素废弃物（如小麦麸皮、甘蔗渣、玉米秸秆、稻壳、椰壳以及其他农工废弃物）是可发酵糖类的重要来源，也因此衍生出多种代谢产物，包括乙醇、木糖醇和有机酸（Silva等人，2020年）。除了作为可再生碳源外，这类生物质还是生产多种具有工业价值的酶（特别是参与分解木质纤维素植物壁的酶）的廉价底物（Sutaoney等人，2024年）。木质纤维素废物的结构复杂性和聚合物多样性赋予了它们强大的诱导潜力，使其成为刺激多种微生物产生特定酶系统的理想底物（Sutaoney等人，2024年；Adsul，2024年）。其中，纤维素（由β-D-葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接而成的均聚物）和半纤维素（主要由木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖组成）起着核心作用。当这些聚合物被用作微生物培养的碳源时，它们会分别诱导纤维素酶和半纤维素酶的合成（Mol等人，2023年；Sharma等人，2024年；Adsul，2024年）。降解细胞壁的酶（如内葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、内木聚糖酶（EC 3.2.1.8）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）和β-木酮糖苷酶（EC 3.2.1.37）在木质纤维素生物质的降解中起着关键作用，并广泛应用于不同的工业领域。在生物燃料生产中，内葡聚糖酶通过切割纤维素纤维的内部区域启动纤维素的降解，而β-葡萄糖苷酶则催化纤维二糖转化为可发酵的葡萄糖，这一过程对于防止其他纤维素酶的反馈抑制及确保葡萄糖单体的有效释放至关重要（Amobonye等人，2021年）。
除了生物能源应用外，这些酶在饮料行业也有重要意义。在酸性pH值及高糖分和乙醇浓度条件下仍具有活性的β-葡萄糖苷酶可以用于释放葡萄糖结合的萜烯，从而提升葡萄酒和果汁的香气复杂度和感官品质（De Oliveira Nascimento等人，2023年）。在这方面，微生物来源的β-葡萄糖苷酶通常优于植物内源酶，后者的活性较低（Singh等人，2016年；Zhang等人，2021年）。同样，木聚糖酶在食品工业中也有广泛应用，尤其是在烘焙过程中，它们可以改善面团的弹性、延展性和抗变形能力（Dahiya等人，2020年）。内木聚糖酶和内葡聚糖酶还能提高饲料中植物纤维的消化率，进而提升畜牧生产的营养吸收和生产性能（Ndou等人，2015年；Fan等人，2023年）。
纤维素酶和半纤维素酶的生产与许多微生物利用木质纤维素生物质作为碳和能源来源的能力密切相关。长期以来，丝状真菌一直被认为是最有效的纤维素酶和半纤维素酶生产者（Sharma等人，2024年）。相比之下，尽管有证据表明酵母也是这些酶的潜在来源，但酵母在这一领域受到的关注相对较少。尽管酵母已被广泛用于糖发酵，但关于酵母来源酶及其生物技术应用的研究仍较为有限（Vaz等人，2021年）。酵母具有多种内在优势，如快速生长速率、易于基因操作以及完善的、可扩展的发酵平台。这些特点使酵母成为发现新酶和开发工业生物技术的理想生物体（Yu等人，2025年）。值得注意的是，Cryptococcus、Pichia、Candida、Trichosporon和Aureobasidium等属的酵母已被报道能够产生内葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内木聚糖酶和β-木酮糖苷酶，这一研究领域虽然尚未得到充分探索，但前景广阔（Biely等人，1980年；Leathers，1986年；Bhadra等人，2008年；Yegin等人，2018年）。鉴于微生物纤维素酶和半纤维素酶的生物技术重要性以及酵母作为这些酶来源的探索尚不充分，本研究旨在探讨Aureobasidium leucospermi LB86酵母利用小麦麸皮进行固态发酵生产这些酶的能力。具体来说，本研究评估了小麦麸皮作为水解酶产生诱导剂的效果，对发酵提取物中的酶进行了功能表征，并计算了A. leucospermi LB86利用小麦麸皮水解产物产生的乙醇量。
**材料与方法**
**微生物和接种物制备**
本研究使用的Aureobasidium leucospermi LB86酵母保存在巴西圣保罗州立大学（UNESP）的应用生物化学与微生物学实验室，储存在含有15%（v/v）甘油的安全管中，冷藏温度为-80°C。用于重新激活的酵母被接种到含有2%酵母提取物、1%蛋白胨和2%葡萄糖的YEPD固体培养基（添加1.5%琼脂）的Petri皿中，然后在30°C下培养48小时。选取一个单独的菌落用于接种物制备。预接种物在250毫升Erlenmeyer烧瓶中配制，其中含有100毫升不含琼脂的液体YEPD培养基，置于30°C下以150转/分钟的振荡速度培养24小时。随后在4°C下以4000转/分钟的速度离心15分钟收集细胞沉淀物，并将其重新悬浮在含有KH2PO4（1.0）、K2HPO4（1.0）、(NH4)2SO4（1.0）和MgSO4·7H2O（0.2）的盐溶液中（Vaz等人，2021年）。该悬浮液用于接种固态发酵培养基。
**固态发酵**
固态发酵（SSF）在用棉塞密封的聚丙烯袋（12×22厘米）中进行，每袋含有4克小麦麸皮作为底物。首先用上述盐溶液湿润底物。发酵装置在121°C、1个大气压下高压灭菌30分钟。冷却至室温后，每袋加入1毫升预接种物中的细胞悬浮液，相当于约8.5毫克的湿生物质。培养物在30°C下静止培养72小时，然后加入50毫升蒸馏水手动混合均匀，随后在100转/分钟的振荡器中摇匀10分钟。混合物通过尼龙布过滤，然后在4°C下以4000转/分钟的速度离心15分钟。收集上清液用于后续的酶活性测定。
**酶活性测定**
首先进行了初步的酶活性筛选，以检测发酵提取物中是否存在内葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和β-木酮糖苷酶。使用相应底物通过特定方法测定每种酶的活性。提前确定了每种酶的反应时间，以确保测量处于催化的线性范围内，从而减少对酶活性的负面影响（如底物耗尽和酶抑制）。内葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别使用1%（w/v）羧甲基纤维素（CMC；Sigma-Aldrich）和1%（w/v）桦木木聚糖（Sigma-Aldrich）在150 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中测定。反应混合物含有50微升酶提取物和450微升底物溶液，于40°C下培养。还原糖的释放量通过二硝基水杨酸（DNS）法测定（Miller，1959年），测量吸光度为540纳米。酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放1微摩尔葡萄糖（内葡聚糖酶）或木糖（木聚糖酶）所需的酶量，基于使用相应糖类制备的标准曲线确定。β-葡萄糖苷酶和β-木酮糖苷酶的活性分别使用2 mM对硝基苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷（pNPG）和对硝基苯基-β-D-木酮糖苷（pNPX）在150 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中测定。反应混合物含有450微升底物和50微升酶提取物，于40°C下培养。反应通过加入2 M Na2CO3终止，随后在410纳米处测定释放的对硝基酚量。酶活性单位定义为每小时释放1微摩尔对硝基酚的酶量，基于使用已知对硝基酚浓度制备的标准曲线计算。
**发酵提取物的浓缩**
在物理化学表征之前，使用QuixStand®超滤系统（QSM-03SP，GE Healthcare）对发酵提取物进行浓缩，该系统配备的膜分子量截留值为10 kDa。
**酶测定**
酶测定使用浓度为4.49毫克/毫升的酶提取物进行。调整反应时间以确保所有测定均处于催化的线性范围内。基于初步评估，纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的培养时间为30分钟，β-葡萄糖苷酶的培养时间为20分钟。
**pH值和温度对酶活性的影响**
使用浓缩的发酵提取物和上述底物评估pH值对酶活性的影响。反应在4.0至10.5的pH范围内进行，间隔0.5个单位，使用以下缓冲液：醋酸钠（pH 4.0–5.0）、MES（pH 5.5–6.5）、HEPES（pH 7.0–8.0）、BICINE（pH 8.5–9.0）和CAPS（pH 9.5–10.5）。在每种酶的最佳pH值下，反应温度范围为30至65°C，间隔5°C。
**热稳定性**
通过在没有底物的情况下将酶溶液在30至65°C之间预培养60分钟，然后在最佳测定条件下测定活性来评估热稳定性。
**金属离子对酶活性的影响**
在不同金属离子（Mn2+、K+、Cu2+、Na+、Li+、Ba2+、Co2+、Mg2+、Fe3+、Cd2+和Hg2+）存在下测定酶活性，每种离子的最终浓度为5 mM。测定在每种酶的最佳pH值和温度条件下进行。没有金属离子时的酶活性视为100%。
**生物质预处理衍生化合物对酶活性的影响**
为了评估酶对木质纤维素生物质预处理过程中常见化合物的耐受性，测试了香草醛、糠醛、5-羟基甲基糠醛（HMF）、没食子酸和单宁酸（最终浓度为5 mM）的影响。测定在每种酶的最佳pH值和温度条件下进行。不含抑制剂的对照反应的活性定义为100%。
**乙醇对酶活性的影响**
为了研究这些酶在饮料加工及同时糖化和发酵（SSF）过程中的应用潜力，评估了10%（v/v）乙醇浓度的影响。在每种酶的最佳pH值和温度条件下测量了酶活性，并在pH 5.0条件下也进行了测量，该pH值是典型酵母发酵过程和发酵饮料的代表性pH值。对于两种pH条件，未添加乙醇的对照反应被视为100%的活性。
**糖类对β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响**
使用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和D-木糖在最终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 M的情况下评估了糖类对β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响。实验在每种酶的最佳pH值和温度条件下进行。在没有糖类的情况下测量的活性被视为100%。
**总蛋白质定量**
使用Bradford测定法（Bradford 1976）确定了微生物提取物中的总蛋白质含量。蛋白质定量在595 nm处进行，使用牛血清白蛋白（BSA）构建的标准校准曲线。
**统计分析**
使用GraphPad Prism（版本5.0）进行了统计分析。应用方差分析（ANOVA）来评估样本间的差异。当p < 0.05时，差异被认为是统计学上显著的。
**结果**
**pH值和温度对A. leucospermi LB86分泌的酶活性和热稳定性的影响**
如图1a所示，大多数酶在酸性条件下表现出更高的活性，在碱性pH值下活性显著下降。纤维素酶的最大活性出现在pH 4.5–5.5（p > 0.05），β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的最大活性出现在pH 6.0–6.5（p > 0.05），而木聚糖酶的最大活性出现在pH 6.0。在pH 9.0时，这些酶的活性均无法检测到。
**物理化学条件对酶活性的影响**
(a) pH值的影响；(b) 温度的影响。数值代表四次独立实验的平均值和标准偏差（±）。
图1b展示了温度对酶活性的影响。纤维素酶在35–55°C之间的活性最大（约1.9 U mg−1，p > 0.05），而木聚糖酶在50–55°C之间达到最大活性（1.8 U mg−1，p > 0.05）。相比之下，β-葡糖苷酶（4.6 U mg−1）和β-木糖苷酶（3.6 U mg−1）在40°C时表现出最佳活性。
**A. leucospermi LB86分泌的酶的热稳定性**
不同酶的热稳定性差异显著（图2）。纤维素酶在30–50°C之间保持了其初始活性的60%以上，但在55°C以上活性急剧下降，低于30%。木聚糖酶在30–55°C之间保持了其初始活性的70%以上，然后在60°C以上显著下降，65°C时剩余活性约为20%。
**糖类对β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响**
评估了D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和D-木糖（0.1–0.5 M）对β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响，以评估其对催化性能的潜在影响。
对于β-葡糖苷酶（图3a），D-葡萄糖导致活性逐渐降低，在0.1 M时剩余活性约为80%，在0.5 M时约为60%。在L-阿拉伯糖的存在下，活性在0.1–0.2 M之间接近80%，并在0.3–0.5 M之间增加到接近90%。D-木糖没有降低活性；相反，在所有测试浓度下观察到轻微的增加。
**金属离子对酶活性的影响**
不同金属离子对纤维素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响总结在表1中。表1显示，HgCl2的存在导致活性显著降低，仅剩下12.4±2.6%的剩余活性。相比之下，MnCl2使活性增加了约25.1%（剩余活性为125.1±5.4%）。大多数氯化物盐的存在下木聚糖酶活性增加，除了CdCl2和FeCl3，它们分别将活性降低到81.4±3.9%和56.0±3.2%。在测试的离子中，MnCl2产生了最强的刺激效应，使木聚糖酶活性几乎翻倍（剩余活性为198.9±6.7%）。
CdCl2的存在下β-葡糖苷酶活性完全丧失。相反，CuCl2使酶活性增加了约174%（剩余活性为274±17.8%）。对于β-木糖苷酶也观察到了类似的趋势，CdCl2使其活性增加了约108%（剩余活性为207.9±6.3%），而其他所有氯化物盐都降低了活性，CuCl2、MnCl2、HgCl2和FeCl3导致活性完全丧失。
**生物质预处理衍生物对酶活性的影响**
表2展示了香草醛、单宁酸、没食子酸、糠醛和5-羟甲基糠醛（HMF）对纤维素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响。这些化合物中的大多数显著影响了酶的活性。
单宁酸对纤维素酶活性影响最大，使其活性降低了约59±6.3%，而其他化合物导致的活性降低不到30%。在糠醛的存在下检测到活性略有增强。对于木聚糖酶，没食子酸的存在导致活性显著下降，使其活性降低到56.2±4.3%。
对于β-葡糖苷酶，没食子酸和单宁酸都导致活性完全丧失，而香草醛和糠醛没有引起显著变化。β-木糖苷酶也表现出类似的趋势：单宁酸完全消除了其活性，而香草醛和糠醛导致活性降低不到10%。
**乙醇对酶活性的影响**
在每种酶的最佳pH值和pH 5.0条件下评估了10%乙醇的影响，并将其活性与相应的对照条件进行了比较。在这些条件下，纤维素酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶的活性发生了变化，而β-葡糖苷酶的活性在两种pH值下均未受乙醇的影响（表3）。
**讨论**
多项研究表明，Aureobasidium属的酵母，特别是Aureobasidium pullulans，能够生产以小麦麸皮为底物的植物生物质降解酶。例如，小麦麸皮已被报道为固态发酵生产纤维素酶和半纤维素酶的有效底物，支持了内葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶的显著活性（Leite等人2007）。类似地，用小麦麸皮培养的A. pullulans产生的半纤维素酶与 feruloyl寡糖的生成有关（Yu和Gu 2014）。小麦麸皮也被确定为A. pullulans生产木聚糖酶的最合适的农业工业底物之一（Yegin等人2017）。尽管A. leucospermi在这一领域的进展有限，尤其是使用小麦麸皮进行固态发酵的酶生产方面的报道在文献中仍然稀少，这突显了本研究的新颖性。
A. leucospermi LB86产生了一个具有互补和协同作用的糖苷酶活性组合，这对于植物生物质降解的应用非常有利（Wanmolee等人2016）。纤维素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的最大活性出现在较酸性的条件下，主要在pH 5.0–6.5之间。这一pH范围特别有利于生物质转化过程，因为某些预处理策略（如蒸汽爆炸和生物处理）可以促进有机酸（如乙酸和甲酸以及来自微生物代谢的酸）的释放和/或形成，从而导致预处理后培养基的酸化（Steinbach等人2020；Wu等人2022）。这里评估的酶提取物似乎非常适合这些条件下产生的化学环境，减少了广泛的pH调整需求，并有助于更经济高效的工艺操作。
此外，纤维素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶在常用的水解过程温度范围（45–55°C）内表现出兼容的热稳定性和最佳活性。纤维素酶和木聚糖酶在50–55°C之间显示出最大活性，这些温度被认为是多糖溶解、生物质浆液粘度降低和转化率提高的最佳温度（Baksi等人2020）。虽然β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶在40°C时表现出最佳活性，但β-葡糖苷酶在更高温度下仍保持显著活性，而β-木糖苷酶的活性可保持到45°C。这种行为使得这两种酶能够与纤维素酶和木聚糖酶协同作用，促进葡萄糖和木质素的最终释放（Amobonye等人2021）。
Aureobasidium属的物种，特别是A. pullulans，被广泛报道为有效的植物生物质降解酶的生产者，尤其是木聚糖酶和β-葡糖苷酶（Ohta等人2001；Leite等人2008；Gautério等人2021）。A. pullulans产生的木聚糖酶通常在pH 4.5–5.0和接近50°C的温度下表现出最佳活性（Gautério等人2021；Junior等人2022），而β-葡糖苷酶通常在pH 4.0–5.5的酸性条件下以及45–75°C的温度范围内表现出最佳活性（Leite等人2008；Baffi等人2013）。因此，A. leucospermi LB86的酶谱符合Aureobasidium酶的功能范围。
由于酶的表征是使用粗提取物进行的，观察到的催化谱可能反映了具有不同生化特性的多种同酶的联合贡献。在生产植物生物质酶的微生物中，通常报道会产生不同的酶异构体，特别是纤维素酶和木聚糖酶，这些酶往往是多种具有互补功能的催化蛋白组成的多酶系统（Sales等人2011）。多种木聚糖酶同酶的存在已在微生物中被广泛描述，可能是由于不同基因的表达或翻译后修饰所致，产生了具有不同催化特性和底物特异性的酶（Kulkarni等人1999）。此外，使用粗酶提取物的研究经常在酶谱中显示多个活性条带，表明存在不同的酶异构体，这些异构体共同构成了表征过程中观察到的整体催化谱（Zanoni等人2021）。
然而，尽管先前的研究通常关注单个酶的表征，特别是A. pullulans的木聚糖酶或β-葡糖苷酶（Ohta等人2001；Gautério等人2021），但本研究强调了A. leucospermi LB86产生的多酶组合，同时包括纤维素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性。这种协调的酶系统，加上酶之间观察到的兼容pH值和温度最适值，为植物生物质转化过程提供了优势，因为有效的糖化依赖于针对纤维素和半纤维素部分的酶的协同作用。因此，由A. leucospermi LB86产生的酶群通过展示了一组适合于植物生物质一体化分解的协调酶的生产，扩展了该属已知的生物技术潜力。不同糖浓度对A. leucospermi LB86中的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性的影响表明，其表现优于文献中 commonly 报道的结果——在这些酶中，β-葡萄糖苷酶通常会被其反应产物（葡萄糖，Madrigal等人，2013年）和β-木糖苷酶通常会被木糖（Cintra等人，2017年）强烈抑制。在本研究中，β-葡萄糖苷酶在0.1 M葡萄糖浓度下保留了大约70%的活性，在0.5 M葡萄糖浓度下保留了60%的活性。这一表现超过了Aureobasidium pullulans UNESP-AP1A的记录，后者在0.4 M葡萄糖存在下仅保留了20%的活性（Baffi等人，2013年）。葡萄糖的抑制通常与暴露的活性位点有关，这些位点促进了抑制性单糖的结合（De Giuseppe等人，2014年）。此外，确定酶活性是被葡萄糖刺激还是被抑制对于工业应用（如酿酒）至关重要，因为在高葡萄糖浓度下某些β-葡萄糖苷酶不适合用于葡萄汁中，但可能在发酵后葡萄糖水平降低时使用（Gallifuoco等人，1999年；Barbagallo等人，2004年）。同样，在木质纤维素糖化过程中，对葡萄糖具有低敏感性的酶对于第二代乙醇生产非常理想（Vaz等人，2021年）。对于β-木糖苷酶，在0.5 M木糖存在下其活性仍保持在80%以上，这与A. pullulans CBS 135684的β-木糖苷酶形成对比，后者在低得多的浓度（0.055 M木糖）下就被完全抑制了（Bankeeree等人，2018年）。这种较低的敏感性可能反映了非竞争性抑制机制，即产物与别构位点结合而不阻断酶-底物相互作用（Jordan和Braker，2007年）。鉴于木糖是β-木糖苷酶的常见抑制剂，这种耐受性显著扩展了β-木糖苷酶在半纤维素水解过程中的应用潜力（Terrasan等人，2016年）。金属离子对酶活性的不同影响表明，某些金属通过与酶结构和活性关键的功能团相互作用来调节催化作用。正如Pereira等人（2017年）所描述的，金属阳离子可以结合到氨基、羧基甚至催化残基上，从而改变蛋白质的折叠和活性。这种机制可能解释了Mn2+对纤维素酶和木聚糖酶的激活作用，以及Cd2+对β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的刺激作用。在这些情况下，离子可能通过有益地影响活性位点的动态或结构稳定性而作为正向调节剂。此外，像Cd2+这样的二价金属可能与催化位点附近的巯基或其他亲核残基相互作用，促进有利于催化的酶结构构象调整。据报道，这种相互作用可以通过调节酶复合物的结构来增强某些糖苷酶的活性（Yamaguchi等人，1990年）。因此，观察到的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的激活可能与Cd2+诱导的活性构象稳定或改善的酶-底物相互作用有关。相反，在Cu2+、Fe3+尤其是Hg2+（一种强氧化剂，可氧化巯基、羧基和芳香基残基）存在下大多数酶的完全抑制，突显了这些酶对金属诱导的结构变化的敏感性。当暴露于来自木质纤维素预处理的化合物时，单宁酸和没食子酸对酶群表现出最强的抑制作用。Ximenes等人（2011年）和Mhlongo等人（2015年）的先前研究也报告了单宁酸和没食子酸对酶活性的完全抑制。众所周知，聚合物酚类，如单宁酸，会与酶形成复合物，导致沉淀和活性丧失（Kim等人，2011年）。尽管有报道称香草醛会抑制纤维素酶，特别是β-葡萄糖苷酶（Ximenes等人，2011年），但在这里没有观察到这种效应。此外，在呋喃醛和HMF存在下，所有酶的活性都保持在70%以上，表明它们对生物质预处理过程中产生的两种主要抑制剂具有相对耐受性（Singh等人，2016年）。这种酶的耐受性与其它产生β-葡萄糖苷酶的物种相比具有对比性，例如A. pullulans ER-16的β-葡萄糖苷酶在5%至20%乙醇浓度下活性逐渐降低（Leite等人，2008年），以及Pichia ofunaensis 1A-14的活性在10%乙醇浓度下降到大约80%（Vaz等人，2021年）。由于高乙醇浓度通常会抑制β-葡萄糖苷酶，因此亟需寻找更具耐受性的菌株（Zhang等人，2021年），本研究中观察到的无抑制现象是一个显著的优势。这一特性对于乙醇生产特别有价值，因为在发酵培养物中最终的 broth 乙醇浓度通常在7%到11%之间（Lemos等人，2017年）。为了更好地评估A. leucospermi LB86产生的β-葡萄糖苷酶的性能，表4提供了与文献中报道的其他微生物的比较分析。该比较包括最佳pH和温度条件，以及对乙醇和葡萄糖的耐受性，从而更全面地评估了酶在不同压力条件下的稳健性。值得注意的是，本研究中表征的酶在乙醇存在下表现出竞争性或更好的耐受性，这增强了其在工业过程中的应用潜力。表4显示了Aureobasidium leucospermi LB86（本研究）与其他文献中报道的物种的生理特性和压力耐受性的比较。列出了最佳pH和温度值，以及在10%乙醇和不同葡萄糖浓度（M）存在下的相对活性（%）。全尺寸表格。β-葡萄糖苷酶作为生物技术工具越来越受到关注，因为它们能够水解植物原料中天然存在的芳香糖苷，从而改善饮料的感官特性。这些化合物通常在感官上是不活跃的，但可以转化为挥发性非糖苷，如萜烯、醇和酚类，从而增强芳香复杂度并增加最终产品的价值（Maicas和Mateo，2016年；De Ovalle等人，2018年）。在葡萄酒和卡恰萨等发酵饮料中，这一应用特别重要，因为这些酶对典型的工艺条件具有耐受性，包括约10-12%（v/v）的乙醇浓度和高糖水平，这些条件通常会限制传统β-葡萄糖苷酶的活性（Lemos等人，2017年；Zhang等人，2021年）。在酿酒过程中，这些酶对糖苷-萜烯复合物的作用会释放出挥发性萜烯，如香叶醇、橙花醇、柠檬醇和α-萜品醇，这些化合物负责增强葡萄酒中的花香和果香（Maicas和Mateo，2016年；Bonciani等人，2018年）。结论尽管酵母在糖发酵方面的研究已经非常深入，但对酵母衍生酶及其应用潜力的系统探索却相对较少。本研究中研究的酵母产生了一组纤维素酶和半纤维素酶，显示出在涉及植物生物质降解的过程中具有很大的应用潜力。酶提取物展示了纤维素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的活性，在轻微酸性的pH和适中的温度下表现出最佳性能。β-葡萄糖苷酶在10%乙醇存在下仍保持活性，并对糖的抑制表现出中等的抗性，这些特性对于发酵和工业过程的应用非常重要。未来的研究应集中在酶的分离、纯化和异源表达上，以及评估它们在工业相关系统中的性能，包括木质纤维素残渣的增值和发酵饮料的风味增强。
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