毛发（毛囊）是高度可及、具有再生潜能的微型器官，其内包含多种具有广泛治疗潜力的体细胞和干细胞群。在本研究中，研究人员探究了拔取的毛发作为再生医学非侵入性组织来源的未开发用途。研究证明了通过无酶外植块培养法，成功从拔取的毛囊中分离并扩增了角质形成细胞和间充质干细胞。毛囊来源的角质形成细胞保持了其上皮细胞特性，并能被高效重编程为诱导多能干细胞。这些iPSCs可进一步被定向分化为定形内胚层和胰腺祖细胞，证实了其强大的自体再生能力。对毛囊间充质干细胞的流式细胞术分析验证了其典型的间充质表型，这些细胞展现了经典的三系分化可塑性以及分化为多巴胺能神经祖细胞的能力。此外，对自体毛囊分泌组的蛋白质组学和囊泡表征显示，其富含再生相关的细胞因子和外泌体。体外实验证明，自体毛囊分泌组具有强大的伤口愈合生物活性。总之，这些研究结果确立了拔取的毛囊是用于基于细胞和细胞外囊泡治疗的高度实用、可扩展的来源，突显了早期毛囊生物样本库在个性化医疗中的临床价值。
一、 研究背景与目的
毛发是人体皮肤中一类高度特化、动态循环的微型器官，具有自我更新、结构复杂的特点。其特殊的微解剖结构中蕴藏着多种干细胞群，驱动毛囊经历生长期、退行期和休止期的周期性循环。其中，外根鞘的角质形成细胞、真皮乳头的间充质干细胞以及毛囊隆突区的神经嵴干细胞等，均展现出多向分化潜能，使其成为再生医学领域极具吸引力的细胞来源。除了细胞本身，毛囊细胞通过旁分泌机制释放的包含生长因子、细胞因子和细胞外囊泡的“分泌组”，也在组织修复中扮演关键角色，为开发无细胞疗法提供了可能。
然而，当前自体细胞疗法的临床转化面临诸多挑战。传统的组织获取方式通常具有侵入性，且伴随苛刻的酶解分离过程，可能导致细胞应激和表型改变。同时，体外长期扩增会诱导细胞复制性衰老，伴随DNA损伤和分泌功能改变，显著削弱其再生与修复能力。此外，供体年龄相关的细胞内在老化也会降低成人干细胞的分化潜能。因此，寻找一种可及、无创、能提供高质量“年轻”细胞的组织来源，并通过早期生物样本库保存以规避衰老影响，对于推动个性化再生医学的发展至关重要。
针对以上问题，研究人员在本研究中系统探究了人毛囊的再生潜能。他们旨在验证拔取的毛囊作为一种非侵入性组织来源，在分离扩增功能细胞、制备诱导多能干细胞以及获取具有生物活性的细胞分泌组等方面的综合价值，并强调早期毛囊冷冻保存（毛囊生物样本库）对实现未来个性化再生治疗的战略意义。本项研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
二、 关键技术方法简述
本研究主要采用了以下关键技术方法。首先，研究人员从28名健康受试者的枕部头皮，通过拔取方式非侵入性地收集了处于生长期的毛囊样本。其次，采用无酶外植块培养法，直接从毛囊块中分离并扩增出了毛囊来源的角质形成细胞和间充质干细胞，避免了酶解对细胞的潜在损伤。再者，利用无整合的附加体方法，成功将毛囊角质形成细胞重编程为诱导多能干细胞，并进一步通过特定诱导方案，将其定向分化为定形内胚层和胰腺祖细胞。此外，利用流式细胞术对分离的间充质干细胞进行表面标志物鉴定，并通过特定的诱导培养基评估其三系（成脂、成骨、成软骨）分化及神经向分化潜能。最后，研究人员收集毛囊细胞在无血清化学限定培养基中培养产生的条件培养基，制备自体毛囊分泌组，并综合运用半定量蛋白芯片、纳米颗粒追踪分析和超分辨显微成像等技术，对其蛋白质、细胞因子组成及外泌体进行表征；同时，利用角质形成细胞划痕实验，在体外评估了该分泌组促进伤口愈合的能力。
三、 研究结果与分析
2.1. 角质形成细胞分离与表征
采用直接外植块培养技术，角质形成细胞在培养的前两周内选择性地从毛囊外根鞘迁移出来。培养的细胞呈现出典型的上皮细胞“鹅卵石”样形态，表现出强大的集落形成能力和持续的增殖潜力。在前十次传代中，细胞稳定表达关键的上皮基底标志物细胞角蛋白14和细胞角蛋白5，表明其保持了祖细胞表型。
2.2. iPSC重编程与胰腺分化
从人毛囊中分离的角质形成细胞被成功重编程为iPSC，并进一步分化为定形内胚层和胰腺祖细胞系。原代角质形成细胞表达K5和K14，而重编程后的细胞群则表达多能性标志物Nanog和SOX2。定向分化后，细胞表达了与定形内胚层身份一致的SOX17和FOXA2，进一步成熟则产生了共表达NKX6.1和PDX1的双阳性胰腺祖细胞。这些结果表明，角质形成细胞来源的iPSCs在适当的分化信号下，具备高效生成胰腺谱系中间细胞的能力。
2.3. MSC分离、表征与分化
从拔取的生长期毛囊中分离MSC后，观察到从真皮乳头区域迁移出的贴壁纺锤形细胞。流式细胞术分析定量证实，分离的毛囊MSC表现出典型的间充质免疫表型，高表达经典标志物CD44、CD73、CD90和CD105。在谱系特异性诱导下，细胞获得了成脂、成骨和成软骨表型，证实了其经典的间充质三系分化可塑性。此外，在诱导条件下，毛囊MSC还表现出神经向分化潜能，呈现出类似神经元的延伸形态，并表达多巴胺能酶酪氨酸羟化酶以及神经元细胞骨架标记物微管相关蛋白2。
2.4. 毛囊分泌组的表征与再生潜能
对来自三名健康供体的毛囊MSC分泌组的半定量蛋白芯片分析显示，其中包含血管内皮生长因子A、纤维连接蛋白和聚集蛋白聚糖等多种与组织再生和免疫调节相关的蛋白。对六名供体样本的进一步分析显示，分泌组中含有皮克/毫升水平的经典再生细胞因子，如VEGF-A、生长激素和FGF-7。纳米颗粒追踪分析证实了分泌组的囊泡成分，其模态粒径约为137纳米，与外泌体大小一致。超分辨成像通过CD81、CD63和CD9三重标记，进一步验证了冻干制备物中外泌体的存在。此外，利用人角质形成细胞进行的体外划痕实验表明，用25%自体毛囊分泌组处理的细胞，在24小时后的伤口闭合率显著高于对照组，显示了其通过旁分泌信号加速上皮修复的能力。
四、 讨论与结论总结
讨论部分要点 ：本研究强调了人毛囊作为易获取的体细胞和间充质干细胞库所具有的多维再生能力。相比于依赖侵入性组织采集和苛刻酶解的传统方法，本研究建立的无酶外植块法能成功分离扩增毛囊角质形成细胞和MSC，并保持其原生祖细胞特性。角质形成细胞因其内源性表达关键上皮转录因子，相比成纤维细胞具有更高的重编程效率，本研究成功将其重编程为iPSC并分化为胰腺祖细胞，证实了其质量。同时，分离的毛囊MSC不仅具有经典的三系分化能力，还能进行神经向诱导，展现了强大的发育多能性。研究对自体毛囊分泌组的表征揭示了其富含再生细胞因子、生长因子和细胞外囊泡。特别是在化学限定、无血清环境中制备的分泌组，其促伤口愈合能力明确归因于自体旁分泌因子和囊泡，而非外源蛋白的干扰。然而，研究也存在局限性：一是分泌组成分复杂，难以精确定位特定可溶成分与囊泡成分的具体贡献；二是蛋白分析的队列规模有限，需要更大样本的研究来评估供体性别、遗传和健康状况等因素对个体分泌组谱的影响。
研究结论 ：人毛囊是一种临床可及、生物多样性丰富的组织，在个性化再生医学中具有日益增长的相关性。它包含多种体细胞和干细胞群，能够参与上皮、间充质和神经再生。此外，毛囊来源的分泌组提供了丰富的营养和免疫调节因子来源，通过旁分泌机制支持组织修复。鉴于自体细胞疗法临床管线的扩展，建立稳健且可及的再生细胞来源是一项关键挑战。在生命早期冷冻保存完整的毛囊，为保持细胞功能和分子完整性、最大程度减少衰老和培养诱导漂变的影响提供了一种实用策略。这种生物样本库方法支持灵活的自体应用，包括iPSC生成、分泌组疗法和生物工程。通过收集年轻细胞并在最佳低温条件下储存，这些毛囊成为再生物质的生物稳定性来源，为未来个性化医学的发展提供支持。
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