酰基载体蛋白（Acyl carrier proteins, ACPs）是动态的、结构保守的α螺旋蛋白，在许多初级和次级代谢过程中处于核心地位。虽然先前的工程化努力集中在策略性诱变和“螺旋交换”上，但ACP序列设计空间的很大一部分仍未得到充分探索。在此，研究人员利用定制的序列生成算法ALGO-CP，采用结合进化与物理化学设计的方法，创造了典型ACP亚类——AcpP的多样化变体。利用ALGO-CP，研究人员生成了两个可溶性候选蛋白ALGO-055和ALGO-059，它们能在体外使用重组修饰酶经历从脱辅基（apo）到全辅基（holo）再到酰基形式的完全翻译后修饰（PTM）。基于这些成功的设计，研究人员进一步改造ALGO-CP以产生多个嵌合体，其中两个——chALGO-012和chALGO-024——同样表现出完全的修饰能力。研究人员通过稳健的分子动力学模拟探究了ALGO变体的结构可塑性，并通过圆二色光谱进一步揭示，ALGO-055和ALGO-059缺乏ACP典型的α螺旋折叠，同时保持可溶性和易于修饰。在对ALGO-055和ALGO-059进行酰化后，研究人员观察到螺旋度的显著增加，表明蛋白质发生了重构。值得注意的是，ALGO-055和ALGO-059在其序列中都拥有几个罕见的氨基酸变异，同时保留了许多参与关键蛋白质-蛋白质相互作用的重要酸性“热点”。通过测试AcpP设计空间的极限，该研究的结果表明，ACP行为的某些关键方面（特别是翻译后修饰）可以在独立于典型结构的情况下得以保留。这项工作通过混合计算-实验方法，为探索ACP序列多样性奠定了基础。ALGO-CP可根据AGPL3.0许可获取。
这篇发表在《RSC Chemical Biology》的论文探讨了酰基载体蛋白（Acyl carrier proteins, ACPs）在工程化设计与结构功能关系中的新发现。ACP作为脂肪酸和非核糖体肽合成中的核心载体，其传统认知依赖于保守的四螺旋束结构来执行底物转运与蛋白质间相互作用（Protein-protein interactions, PPIs）。然而，既往研究多局限于同源建模与定点突变，未能充分探索序列空间的新颖性。为此，研究人员开发了名为ALGO-CP的序列设计算法，旨在突破自然进化的限制，从头创建具有功能活性的ACP变体。
为实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，基于大规模多序列比对（Multiple sequence alignment, MSA）开发了结合进化保守性与物理化学性质的ALGO-CP算法，通过调整权重系数r平衡序列保守与探索；其次，利用AlphaFold3进行结构预测，并结合分子动力学（Molecular dynamics, MD）模拟评估蛋白骨架稳定性与4'-磷酸泛酰巯基乙胺（4'-phosphopantetheine, 4'-PP）的动态行为；第三，通过体外一锅两步法翻译后修饰（Post-translational modification, PTM）实验，利用4'-PPT酶（如EcAcpS）和酰基-ACP合成酶（AasS）验证候选蛋白的功能转化能力；最后，运用圆二色光谱（Circular dichroism, CD）分析不同修饰状态下的二级结构变化。
研究结果如下：
ALGO-CP概念与总结
研究人员设计了ALGO-CP算法，该算法融合了基于位置保守性的route-AC和基于物理化学性质（等电点pI、疏水性HKD、范德华体积）的route-AP。通过调整权重系数r，算法能够生成介于严格进化约束与完全理化性质驱动之间的序列，从而在保留关键功能残基的同时引入罕见的氨基酸变异。
Designing AcpP variants using ALGO-CP
通过对2167个AcpP同源序列的分析，研究人员确定r=0.60时为序列保守性与探索性的最佳平衡点。在此参数下生成的序列经AlphaFold3预测具有良好的折叠置信度（pLDDT=90.1±2.75），且理化性质介于纯保守与纯探索设计之间。
Expression, purification and PTM of ALGO sequences
从随机选取的七个候选蛋白中，ALGO-055和ALGO-059被证实可溶且能进行完整的PTM。质谱分析显示，这两种蛋白可在体外被EcAcpS转化为holo形式，并被Vibrio harveyi的AasS（VhAasS）加载月桂酰基（C12）。值得注意的是，当固定在Ni2+树脂上时，PTM效率降低，表明构象灵活性对酶的识别至关重要。此外，由ALGO-055和ALGO-059衍生的嵌合体chALGO-012和chALGO-024也表现出完全的修饰能力。
In silico biophysical characterisation
分子动力学模拟显示，尽管ALGO变体与天然EcAcpP具有相似的静电势和分子亲脂性势，但其动态行为存在差异。ALGO-055在所有状态下均表现出优异的稳定性，而ALGO-059则表现出显著的构象可塑性和螺旋丢失。模拟还揭示了4'-PP基团的运动与蛋白质主链去稳定化之间存在相关性。
CD spectroscopy of ALGO variants
圆二色光谱结果出乎意料地显示，apo和holo形式的ALGO-055及ALGO-059并不具备典型α螺旋的特征信号（208nm和222nm处的双负峰）。然而，在C12酰化后，两者的螺旋度显著增加，表明酰基负载诱导了结构的重组装。这一发现挑战了结构预测工具基于预折叠模型的假设。
Primary sequence analysis
序列分析表明，ALGO-055和ALGO-059含有大量罕见氨基酸变异（<5%发生率），但仍保留了关键的酸性热点区域以维持与修饰酶的静电互补性。相比之下，失败序列中富集的特定变异（Grantham距离>120）主要集中在螺旋αI和αIV区域，而非关键的识别螺旋αII。
综上所述，讨论部分指出，ALGO-055和ALGO-059代表了首个完全由计算机算法从头设计并具有功能的ACP。它们展示了在没有典型α螺旋结构的情况下仍能保留核心生化功能（PTM）的能力。这种现象可能反映了ACP进化过程中的一种“前体样”状态，即关键接触残基的非结构化排列足以支持修饰，而随后的折叠可能是在底物结合或伴侣辅助下完成的。研究结论强调，ACP的 canonical 折叠可能是为了适应更复杂的生物合成精度和伙伴选择性而演化出来的，并非PTM的绝对前提。这项工作确立了ALGO-CP作为一种强大的工具，可用于探索序列设计空间并创造新的ACP谱系，为代谢工程和生物催化提供了新的视角。
