新型红球菌菌株在高负载条件下对对苯二甲酸的降解作用及多种生物产物的生成

摘要
从聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）解聚得到的对苯二甲酸（TPA）是微生物升级转化（upcycling）的一个有前景的后底物，但尚未有报道其在超过120 mM的高浓度下能够完全降解。在这里，我们报告了从使用TPA作为唯一碳源的堆肥富集培养物中分离出的七株红球菌（Rhodococcus）菌株。其中三株菌株在高渗透压条件下，在最小培养基中完全消耗了240 mM的TPA，超出了之前报道的阈值。TA18菌株仅以TPA为碳源，产生了β-连接的外多糖和主要由3-羟基戊酸组成的聚羟基烷酸酯，这两种物质在红球菌属中都未曾被描述过，同时还产生了C16和C18脂肪酸。这些菌株扩展了可用于PET升级转化的TPA降解能力强的细菌种类，并为开发将塑料废物转化为多种微生物产品的途径奠定了基础。

引言
塑料在现代社会中被广泛使用，但不恰当的处理和生产过程中的泄漏导致了广泛的环境污染（Geyer等人，2017年）。回收仍然是减少塑料积累和对原始化石基材料需求的主要策略。在各种塑料中，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）因其广泛用于包装和纺织品而具有最高的回收率，2020年的回收率达到了23%，而整体塑料的回收率仅为9%（Duan等人，2024年）。然而，回收既没有解决对持久性合成聚合物的依赖问题，也没有为已经在循环中的塑料提供可持续的终结处理方案，这些塑料仍然容易泄漏到环境中。化学回收提供了一个补充途径，因为从PET单体回收对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）在经济上是可行的，其中通过机械化学解聚生产TPA的成本约为0.99美元/公斤，而从石油来源生产TPA的成本约为1.14美元/公斤。然而，经济利润空间不大，并且对原料成本和下游纯化步骤非常敏感（Anglou等人，2024年）。另一种策略是将PET废物重新导向其他生产链。通过化学或酶解聚释放的单体可以用作微生物的原料，将废物处理与可持续的生物生产相结合，有可能提高塑料废物管理的经济激励（Qi等人，2022年）。

在对苯二甲酸（TPA）中，TPA占PET质量的约83%，与EG不同，EG可以被多种微生物轻松转化为乙酸（Carniel等人，2024年），TPA的降解仅限于具有专门芳香族降解途径的细菌。微生物对TPA的吸收始于转化为原儿茶酸，然后通过三种环裂解途径之一生成中间代谢产物。因此，TPA的降解能力仅限于少数几种细菌，其中Comamonas、Pseudomonas和Rhodococcus是最常用于生物升级转化研究的属（Somiza等人，2026年）。基因工程也被用来扩展从TPA获得的产品种类。例如，一种经过工程改造的Pseudomonas putida KT2440能够将BHET衍生的TPA转化为β-酮戊二酸，尽管未能完全消耗可用的120 mM TPA（Werner等人，2021年）。在野生型菌株中，据报道Rhodococcus erythropolis在优化条件下可以在84小时内完全消耗120 mM TPA，并且通过FTIR确认了PHA的积累（Maurya等人，2024年），这代表了迄今为止报道的最高TPA完全降解浓度。

在这里，我们报告了从使用TPA作为唯一碳源的堆肥富集培养物中分离出的七株红球菌（Rhodococcus）菌株。其中三株菌株在高渗透压条件下，在最小培养基中完全消耗了240 mM TPA，超出了之前的报道阈值。TA18菌株不仅产生了β-连接的外多糖和主要由3-羟基戊酸组成的聚羟基烷酸酯（PHA），这两种物质在红球菌属中都未曾被描述过，同时还产生了C16和C18脂肪酸。这些菌株扩展了可用于PET升级转化的TPA降解能力强的细菌种类，并为开发将塑料废物转化为多种微生物产品的途径奠定了基础。

材料与方法
**对苯二甲酸消耗菌株的筛选**
从添加了TPA的富集培养物中分离出的菌株，在含有桉树叶和粪肥的培养基中，在30°C和50°C下培养。培养基成分见表S1。通过测量OD600值来监测微生物生长。培养72小时后，使用高效液相色谱（HPLC）定量培养基中的残余TPA浓度。根据72小时培养后的相对TPA消耗量对菌株进行分类（表S2）。选择TPA消耗量超过90%的菌株进行分类鉴定，并在更高浓度的TPA下进一步培养。富集培养物的准备和HPLC方法的详细信息分别见补充方法（SM）1和2。

**选定菌株的进一步培养**
将选定菌株在添加了240 mM TPA的矿物盐培养基（MSM40）中进一步培养。为了完全溶解240 mM TPA，在接种前向MSM40中添加了450 mM NaOH，生成溶度更高的邻苯二甲酸钠（Na2TPA）。加入HEPES缓冲液（110 g L⁻¹）以维持整个培养过程中的pH稳定性。通过定期测量OD600值来监测生长情况，直到生长停止，然后使用HPLC定量培养基中的残余TPA浓度。

**细菌鉴定和菌株分离**
使用Sherlock Microbial Identification System（MIDI, Inc., USA）来确定菌株是否属于不同的菌株。比较了脂肪酸甲酯（FAME）谱，并使用该系统软件生成基于欧几里得距离的树状图。设定了一个截止值2.5，以将样品分类为属于同一菌株（ED < 2.5）或不同菌株（ED > 2.5）。根据MIDI的建议方案，使用7890 A气相色谱仪（Agilent Technologies）获得并分析了脂肪酸甲酯（Schutter和Dick，2000年）。简要来说，大约5毫克湿生物量在100°C的水浴中用NaOH和甲醇溶液进行皂化，将细胞脂质转化为钠盐。为了获得FAME，使用酸化甲醇（HCl:MeOH）对脂肪酸进行衍生化。第二次加热后，加入十六烷和甲基叔丁基醚的混合物进行有机相和水相分离，收集含有FAME的有机相进行分析。

**部分16S rRNA基因序列的获取和鉴定**
通过Sanger测序获得部分16S rRNA基因序列，并将其存入GenBank数据库（表S3），然后使用BLASTn进行比较。共有14个序列被纳入分离菌株与参考序列之间的系统发育分析。参考序列是根据BLASTn结果选择的，包括与TPA降解相关的最接近组的模式菌株和该组内先前报道的物种。完整的分子方法和系统发育参数见SM3。

**生物表面活性剂的生产测定**
将菌株分别在添加了60 mM TPA（MSM10）、大豆油（20 g L⁻¹）或正十六烷（20 g L⁻¹）的矿物盐培养基中培养。培养物在30°C下以200 rpm的轨道振荡速度培养168小时。培养后，离心培养物，使用油扩散试验评估无细胞上清液的生物表面活性剂产量。简单来说，将15 µL原油层放在40 mL蒸馏水中。在形成均匀的油膜后，向油表面加入10 µL培养上清液。如Morikawa等人（1993年所述，生物表面活性剂的产生表现为形成透明的油扩散晕圈。

**外多糖的生产测定**
为了评估外多糖（EPS）的产生，将菌株在添加了calcofluor white（0.2 g L⁻¹）的MSM10琼脂上培养72小时。外多糖的产生通过紫外光（365 nm）下的菌落荧光来指示（Leigh等人，1985年）。

**聚羟基烷酸酯的生产测定**
最初通过在MSM10琼脂上培养菌株72小时（30°C）来筛选聚羟基烷酸酯（PHA）的产生。对于所有用于PHA生产的培养基，氮源浓度减半（0.25 g L⁻¹ NH4Cl），以促进向储存化合物的碳流。菌落用乙醇中的尼罗蓝硫酸盐溶液（0.5 g L⁻¹）染色，PHA的产生通过紫外光（365 nm）下的荧光来指示（Kitamura和Doi，1994年）。PHA生产的比较使用了Oshiki等人（2011年）设计的微孔板实验。选定的菌株在96孔板中的200 µL MSM10中培养72小时（30°C），每个孔有三个重复。通过测量OD600来确定细胞生长，然后用尼罗蓝硫酸盐（2.2 g L⁻¹水溶液）染色。荧光分别在490 nm和590 nm的激发和发射波长下测量。通过将染色前后的荧光值差异归一化到OD600来计算相对PHA生产量。使用单因素方差分析（ONE WAY ANOVA）和Tukey检验进行PHA生产的比较，显著性水平为0.05。使用葡萄糖补充的矿物培养基中生长的Escherichia coli ATCC 25922作为阴性对照。选择产生最高PHA产量的菌株通过气相色谱-质谱（GC/MS）进行PHA特征分析。

**PHA单体的表征**
根据Oehmen等人（2005年）的方法，使用在MSM10中培养的TA18菌株的生物质和苯甲酸钠作为内标，进行了PHA单体的提取和衍生化。使用气相色谱-质谱（GC/MS）分析衍生化样品。色谱峰被分配给NIST14数据库中匹配最好的化合物，从而能够识别PHA单体和其他存在于衍生化生物质中的脂质相关化合物（见SM4）。

结果与讨论
**TPA利用细菌的分离与鉴定**
从在30°C下孵育的MM5富集培养物中分离出总共42株细菌菌落。在50°C下进行的富集结束时未观察到浊度增加。在50°C下没有微生物生长，表明测试堆肥中的TPA降解菌群主要是中温菌，这与TPA升级转化研究中未报道耐热和嗜热菌株的情况一致（Somiza等人，2026年）。分离出的菌株依次命名为TA1至TA42（详见表S2）。其中七株菌株（TA18、TA21、TA27、TA33、TA34、TA38和TA39）在72小时内降解了超过90%的TPA；因此，它们被选用于后续实验。其余的分离株未被鉴定或进一步表征。

**基于欧几里得距离的分类**
根据MIDI系统生成的脂肪酸谱，这七株菌株被认为是不同的菌株（图1）。此外，对部分16S rRNA基因序列的BLASTn分析表明Rhodococcus pyridinivorans是与所有选定菌株最接近的匹配属。尽管仅凭16S rRNA基因测序不足以进行物种水平的鉴定，但高自助值（图2，箭头）支持将这些菌株归类为红球菌属。因此，这些菌株被分类为红球菌属。

**系统发育树**
基于16S rRNA基因测序的系统发育树，将分离株与其他由BLASTn鉴定的相应属的菌株进行比较。节点值表示使用最大似然法和10,000次自助法推断的自助支持。Gordonia rubripertincta和Nocardia brasiliensis被用作树的根群外群。

**分类的意义**
所有七株菌株被归类为红球菌属与其已知的可吸收芳香族化合物和外来化合物的能力一致（Ivshina等人，2022年），以及Rhodococcus jostii RHA1作为TPA降解的模型生物（Hara等人，2007年）。除了降解能力外，该属的成员还被认为能够产生具有生物技术意义的化合物，包括生物表面活性剂、色素、铁载体、聚羟基烷酸酯（PHA）和三酰甘油（TAGs）（Cappelletti等人，2020年），这为使用TPA作为碳源研究它们的生物合成潜力提供了合理的依据。

**菌株的生长曲线和TPA消耗**
在MSM40上的生长表现突显了通常归因于红球菌属的耐压性和 robustness。基于中等成分组成，MSM40的预计渗透压约为1.2奥斯摩尔（Osm），大约是Lysogeny Broth渗透压（约0.41奥斯摩尔）的三倍。尽管使用的NaOH和HEPES的高浓度产生了显著的渗透压和离子压力，所有菌株都在最小培养基上生长并达到了较高的细胞密度。OD600测量值表明，在11天后生长明显稳定，大多数分离株的最终OD600约为24（图3）。图中所示的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像显示了在含有240毫摩尔（mmol）TPA作为唯一碳源的MM培养基中分离株的生长情况。所有菌株的初始OD600设定为0.1。数据点代表平均OD600值，条形图表示培养上清液中的TA浓度，在第1、3、5、8和11天进行测量。所有分析都进行了三次重复实验，误差条表示相应平均值的标准偏差。

这一特性对于工业应用尤为重要，因为在恶劣的工艺条件下，许多有前景的微生物难以使用，而渗透压应激是一个常见的限制因素（Kuang等人，2024年）。即使在这些条件下，仍有三个分离株在11天或更短时间内完全降解了240毫摩尔TPA（TA18、TA27和TA33）。这些分离株对240毫摩尔TPA的完全消耗超过了先前报道的野生型菌株的最高消耗量——之前的研究是在添加酵母提取物的优化条件下，Rhodococcus erythropolis在84小时内完全消耗了120毫摩尔TPA（Maurya等人，2024年）。当前结果是在严重的渗透压压力下，在最简单的培养基中获得的，这表明这些分离株在这种渗透压和营养条件具有更强的适应性。作为对比，Werner等人（2021年）在使用Pseudomonas putida KT2440生产β-酮己二酸的研究中使用的最高TPA浓度也是120毫摩尔，尽管在那项研究中并没有实现TPA的完全消耗。

MSM40中使用的NaOH介导的TPA溶解过程生成了Na2TPA作为主要的溶解产物，这种物质在碱性PET水解过程中也会产生（Barnard等人，2021年），从而将这里的培养条件与 deriving from 副产物的流动过程联系起来。作为参考，Anglou等人（2024年）将Na2TPA的浓度维持在476毫摩尔（约10重量%）以下，以确保水解产物的完全溶解，这意味着只需将其稀释两倍即可直接用作原料。这种集成还可以跳过TPA纯化所需的某些下游步骤，如酸化、沉淀、过滤和中和，同时能够生产出比回收TPA具有更高附加值的生物产品，有助于降低成本并提高整体工艺的经济性。尽管这些产物流中也会含有乙二醇和其他副产品，但这些菌株在最简单的培养基中在渗透压挑战性条件下仍能生长并完全消耗TPA，这代表了PET水解和升级回收生物学整合的一个重要步骤。此外，这些菌株在这种条件下产生的高密度培养物体现了它们的生理适应性以及未来工艺开发的潜力，例如工艺放大。

在所有测试条件下，无细胞上清液中未检测到外源表面活性剂。然而，在生长在正十六烷和大豆油中的培养物中观察到了油-水界面的可见变化，表明界面张力发生了变化。基于这一观察，我们假设这些表面活性剂与细胞相关联而不是释放到培养基中。为了验证这一点，将从正十六烷和大豆油中培养的菌体颗粒进行了油扩散试验，并得到了阳性结果。这种现象在几种Rhodococcus菌株中都有报道，可能通过增加细胞表面的疏水性来提供生态优势，从而促进其对疏水性基底的附着（Sharma等人，2021年）。相比之下，在TPA培养物中未检测到表面活性剂活性，因此进一步表征超出了本研究的范围。

此外，所有选定的分离株在UV光下呈现出白蓝色荧光，当TPA作为唯一碳源时，表明产生了含有β连接多糖的EPS（图4B）。尽管在其他培养条件下也报道过Rhodococcus会产生EPS（Krivoruchko等人，2026年），但我们的结果表明，这种表型仅在完全以TPA为碳源时也会出现，说明从TPA中获得的碳不仅用于生物量形成，还用于细胞外多糖的生物合成。这扩展了与TPA同化相关的生物产物的范围。需要进一步的成分分析来确定从TPA产生的聚合物的结构。

最后，多羟基烷酸（PHA）积累实验表明，大多数分离株在染色后显示出强烈的荧光，而TA38和TA39分离株的荧光很低或没有可见荧光（图4D）。为了比较不同分离株的PHA产生情况，我们采用了Oshiki等人（2011年）提出的方法，并将其适配到96孔板格式。与基于板的实验结果一致，TA38和TA39分离株与阴性对照组没有显著差异（Tukey检验，p>0.05），因此被排除在测试条件下的PHA积累菌株之外（图5）。通过对菌株进行全基因组测序等基因组分析，可以为观察到的特征提供遗传背景，并可能解释TA38和TA39缺乏PHA积累的原因。相比之下，TA18分离株被归类为最高荧光组，并且与TA34分离株（表现出最低平均荧光）有显著差异（Tukey检验，p<0.05）；因此选择TA18进行进一步的脂质化合物特征分析。

GC/MS分析表明，从TA18分离株衍生的生物质在色谱图中显示出三个主要峰（图6）。这些峰与NIST14质量光谱数据库进行了比对，被鉴定为3-羟基戊酸酯（3HV）、十六酸（棕榈酸）和一种不饱和C18:1脂肪酸的甲酯，相似度分别约为88%、97%和96%。尽管3-羟基戊酸酯的相似度指数未达到推荐的90%阈值，但其碎片化模式与3-羟基脂肪酸甲酯一致，且PHA的积累也得到了Nile blue荧光实验的独立支持。C18:1峰与9-十八烯酸（油酸）和10-十八烯酸（异油酸）的得分相同（96%）；由于GC/MS无法分辨这两种异构体，我们将其称为C18:1脂肪酸。通过FTIR或NMR确认单体组成是下一步必要的步骤，因为之前尚未有报道指出Rhodococcus可以从TPA作为唯一碳源产生纯的聚（3-羟基戊酸酯）（PHV）。在该属中，唯一关于纯PHV的先前报道是关于在五种碳有机酸上生长的Rhodococcus ruber（Haywood等人，1991年）。

通过荧光量化的PHA产生情况显示为四次生物学重复实验的平均值及相应的标准偏差。使用在葡萄糖中生长的E. coli ATCC 25922作为阴性对照。根据Tukey检验，在5%的概率下，具有相同字母的平均值之间没有显著差异。

GC/MS分析显示，从TA18分离株衍生的生物质在色谱图中揭示了三个主要峰（图6）。这些峰与NIST14质量光谱数据库进行了比对，被鉴定为3-羟基戊酸酯（3HV）、十六酸（棕榈酸）和一种不饱和C18:1脂肪酸的甲酯，相似度分别为88%、97%和96%。尽管3-羟基戊酸酯的相似度指数未达到推荐的90%阈值，但其碎片化模式与3-羟基脂肪酸甲酯一致，且PHA的积累也得到了Nile blue荧光实验的独立支持。C18:1峰与9-十八烯酸（油酸）和10-十八烯酸（异油酸）的得分相同（96%）；由于GC/MS无法分辨这两种异构体，我们将其归类为C18:1脂肪酸。通过FTIR或NMR确认单体组成是下一步必要的步骤，因为此前尚未有报道指出Rhodococcus可以从TPA作为唯一碳源产生纯的聚（3-羟基戊酸酯）。