摘要
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种致命的跨境疾病。自2019年在韩国首次被发现以来，ASFV持续感染野猪，给经济和生态带来了重大负担。我们通过分析2019年至2024年间收集的4,209份ASFV阳性野猪样本，使用多标记方法（包括B646L（p72）、I73R/I329L基因间的区域（IGR）、MGF 360-1La和MGF 505-9R/10R）研究了ASFV的遗传多样性和传播动态。所有分离株通过p72分析被归类为基因型II。IGR II占主导地位，而在2019-2020年间检测到一例IGR I和三例IGR III。IGR III在2023年重新出现，并在2024年增加。韩国特有的MGF 360-1La突变（L106P）于2020年出现，在2021年达到峰值，此后以低频率持续存在。观察到MGF 505-9R/10R谱型的变化：MGF-1在2020年之前占主导，而MGF-5在2021年出现并在2024年成为主导。据此，ASFV菌株被分为六个具有不同空间分布和传播轨迹的簇。簇1代表最初的入侵和早期传播，早期检测到两个次要亚簇（1.1和1.2）；簇2保持局部化，簇3向东南方向扩展并成为主导，簇4仅限于庆尚北道东部。这些发现表明，尽管韩国的ASFV起源于单一基因型II的引入，但检测到多个谱系反映了病毒的多样化或额外的入侵。使用遗传标记进行持续的分子监测，并结合全基因组分析，对于检测早期变异株和制定有效的ASF控制策略至关重要。
引言
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度传染性和致命性的病毒性疾病，影响家猪和野猪，死亡率接近100% [1, 2]。这种疾病对全球养猪业构成了严重威胁。2019年9月16日，韩国庆尚北道坡州的一个养猪场报告了首例ASF疫情 [3]。2019年10月3日，在非军事区西北部检测到首例ASFV感染的野猪 [4]。随后，野猪中的ASF感染持续向东和向南扩散 [5]。2019年发生了14起疫情，2020年2起，2021年5起，2022年7起，2023年10起 [6]。这些疫情给韩国养猪业带来了巨大的社会经济负担。
ASFV是一种属于Asfarviridae科Asfivirus属的包膜双链DNA病毒 [1, 7]。与其他双链DNA病毒类似，ASFV基因组高度保守，核苷酸替换（病毒进化的主驱动力）发生速度相对较慢 [8]。此外，已在多个野外分离株中报告特定基因组区域的自然缺失，这也可能促进ASFV的进化和表型变化 [9]。因此，使用特定分子标记分析ASFV的遗传变异（包括核苷酸替换和缺失）对于理解病毒进化和传播途径至关重要 [9, 10]。B646L（p72）羧基末端的测序是将其分类为24个不同基因型的常用标准标记 [11, 12]，这是全球系统发育分类的基础。基因型I是最早表现出洲际传播的，于1957年和1960年从西非引入葡萄牙，随后传播到其他欧洲国家、南美洲和加勒比地区 [2, 13]。2007年，基因型II ASFV从南部非洲引入格鲁吉亚，开始在东欧迅速传播 [14]。该病毒随后传播到亚美尼亚（2007年8月）和俄罗斯联邦（2007年11月），并于2018年首次在中国报告 [15]。从中国开始，基因型II ASFV迅速扩展到邻近的亚洲国家，最终在2019年到达韩国 [16,17,18,19]。
虽然B646L有助于ASFV基因型分类，但基因型II病毒的高度遗传同质性限制了其在追踪病毒来源、传播途径或进化动态中的应用 [20]。为了克服这些限制，已经鉴定并应用了额外的分子标记。例如，I73R/I329L和MGF 505-9R/10R基因间的基因间区域（IGR）中的串联重复序列（TRS）被用来区分在东欧和亚洲传播的基因型II亚群 [10, 21,22,23,24,25]。特别是I73R和I329L基因间的基因间区域被广泛用作基因型II ASFV的标准亚型标记，可将病毒分为四种变体，分别命名为IGR I、II、III和IV [26]。此外，O174L、K145R和MGF 505-5R中的单核苷酸多态性被用于区分波兰、罗马尼亚和德国等国家的区域簇 [24, 25, 27]。在越南，报道了A179L/A137R IGR内的11-bp插入，为进一步细分基因型II病毒提供了依据 [28]。
尽管每个标记都提供了有价值的见解，但单独使用时其分辨率有限。因此，最近的研究采用了多标记方法，整合多个遗传标记以实现高分辨率的分子流行病学分析。在欧洲，使用中心变异区域（CVR）、IGR（I73R/I329L；MGF505-9R/10R）、O174L和K145R对2007年至2022年间收集的382个ASFV分离株进行多标记分析，将其分为24个遗传簇，有助于识别新的入侵事件和详细的传播动态 [24]。同样，在意大利（2022-2023年），结合使用CVR、IGR（I73R/I329L）、O174L和K145R标记揭示了主导群体和新出现的簇，从而评估野猪和家猪病例之间的流行病学联系 [29]。这些研究表明，多标记分析是高分辨率解析ASFV传播途径和区域联系的强大工具。然而，对韩国野猪中ASFV的系统多标记分析仍然有限。
2019年以来，韩国持续进行了基于分子标记的ASFV分析。这些研究揭示了基因型II内的多种突变组合，表明新的病毒谱系正在形成和传播。在这项研究中，我们使用四种遗传标记（p72、IGR、MGF 360-1La和MGF 505-9R/10R）对2019年至2024年间检测到的野猪中的ASFV菌株进行了多标记分类，分为六个遗传簇，包括四个主要簇和两个次要亚簇。通过这项分析，我们旨在阐明ASFV在韩国的空间分布、传播途径和新谱系的出现，为有效的疾病控制和管理策略提供基本见解。
材料与方法
2019年至2024年ASF发生情况的空间分析和遗传分组
2019年至2024年间，共有4,209例ASFV阳性的野猪病例被纳入空间分析，其疫情位置使用ArcGIS Pro版本3.2（Esri，美国加利福尼亚州雷德兰兹）和QGIS版本3.4进行绘制。基于每个确认病例的地理坐标，可视化了空间分布和移动模式。仅对具有完整分子标记信息的样本进行遗传分组，然后将这些标记定义的簇叠加到空间数据集上进行可视化。
野猪样本中ASFV的检测
使用Maxwell RSC Viral Total Nucleic Purification Kit（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）按照制造商的协议从野猪血液样本中提取DNA。使用市售的VetMAX™非洲猪瘟病毒检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商的说明进行实时PCR，使用5 µL提取的DNA。ASFV在FAM通道中被检测到，而内部阳性对照（IPC）在VIC通道中被检测到。IPC用于监测提取的核酸质量并检测潜在的PCR抑制。所有反应均使用Applied Biosystems QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，英国佩斯利）进行。常规PCR使用B646L（F: 5′-GGCACAAGTTCGGACATGT-3′, R: 5′-GTACTGTAACGCAGCACAG-3′）[11]和PPA（5′-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3′, R: 5′-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3′）[30]引物针对ASFV B646L（P72）基因内的区域进行。常规PCR扩增使用Applied Biosystems ProFlex系统进行，所得PCR产物使用Sanger测序（韩国大田）进行纯化和测序。
目标基因的PCR扩增和测序
使用表1中详述的引物进行ASFV的PCR扩增。目标基因使用BioFACT 2X Multi-Star PCR系列DNA聚合酶试剂盒（BioFACT，韩国大田）进行扩增。PCR的退火温度分别为B646L和PPA设为60°C，MGF 360-1La设为58°C，I73R/I329L设为56°C，MGF 505-9R/10R设为56°C。扩增的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶（BioFACT，韩国大田）上电泳，并与1-kb DNA加梯子（BioFACT，韩国大田）进行比较以验证扩增成功。每个PCR反应的单独份样提交给BioFACT进行酶法纯化和Sanger测序。原始Sanger色谱文件导入Geneious Prime版本2025.1.2（Biomatters Ltd., 新西兰奥克兰）。检查碱基调用和质量分数，并使用内置的质量修剪功能（错误概率限为0.01，大约对应Phred Q20）修剪5′和3′端的低质量碱基。对于每个扩增子，反向读取进行反向互补，并在Geneious Prime中与相应的正向读取对齐，从重叠区域生成单一共识序列。当两个读取之间存在差异时，重新检查色谱图，并选择具有更高峰值质量和Phred分数的碱基作为最终序列。
表1 本研究中使用的引物特征
ASFV的系统发育分析
为了确定ASFV的系统发育关系，使用Geneious Prime版本2025.1.2（2024年7月29日访问）中的快速傅里叶变换算法进行了多序列比对。随后，使用Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）11中的ClustalW工具基于ASFV的完整基因组构建了最大似然（ML）系统发育树，以评估树拓扑的可靠性 [31]。为了评估系统发育树的稳健性，使用1000个重复进行了ML自助分析。
完整的ASFV基因组测序和分析
使用酶法文库制备试剂盒（Celemics，韩国首尔）在剪切基因组DNA（gDNA）后进行文库制备。然后将gDNA文库与捕获探针杂交，使用目标富集试剂盒（Celemics），其中包含设计用于与目标区域杂交的化学合成探针。进行PCR后扩增以富集捕获的片段。使用Illumina NextSeq 550平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）以2×150 bp配对末端读取配置对目标富集文库进行测序。使用Fastx Toolkit 0.0.14去除接头序列和低质量碱基，并使用AdapterRemoval版本2.2.2进行额外修剪。使用Burrows–Wheeler Aligner（BWA）版本0.7.10将清洁的读取映射到参考ASFV基因组（登录号：FR682468）。单核苷酸多态性（SNPs）、插入缺失（indels）和结构变异是使用Genome Analysis Toolkit（GATK）版本4.0.4.0识别的。读取对齐质量使用SAMtools（版本1.1）和Python包NumPy（版本1.11.0）进行评估。
**遗传聚类和方向性移动分析**
在这项研究中，分析了2019年至2024年间在韩国检测到的4,209例ASFV阳性野猪的遗传和空间数据。每个样本根据四个分子标记的组合被分类到六个遗传组之一（Cluster 1、1.1、1.2、2、3和4）：IGR、p72基因型、MGF 360-1La变异以及MGF 505-9R和10R之间的TRS。所有样本都接受了分子标记分析；然而，一些样本提供了不完整的遗传信息或产生了无法分类的标记组合。由于聚类分配需要所有四个位点的完整信息，因此在2019-2024年间收集的样本中大约有70%可以被分配到一个遗传组。生成了标准偏差椭圆来可视化每个遗传组的空间分散情况。这些椭圆是基于x和y坐标的协方差矩阵计算的，以每个组的平均中心为参考[32]。主轴和次轴的长度和方向代表了每个组内ASFV病例的方向和空间扩散。这项分析是使用ArcGIS Pro（Esri，加利福尼亚州雷德兰兹）中的空间统计工具进行的。
**评估时间移动趋势**
样本数据按年份分组，并为每个簇-年份子集计算了空间中位中心。中位中心最小化了与组内所有特征的总欧几里得距离，并且比平均中心对异常值不那么敏感。它是使用一种迭代算法计算的，该算法最小化了到所有点的距离之和[33]。接下来，按时间顺序连接每年的中位中心以可视化移动轨迹。随后，使用ArcGIS Pro中的Calculate Geometry Attributes工具中的Line Bearing函数分析了移动方向。该函数计算每条线段的起点和终点之间的方位角（bearing），从真北方向顺时针测量，值范围从0°到360°（例如，0°=北，90°=东，180°=南[34]，270°=西[35]）。方位角（β）使用以下公式计算[34]：
$$^\circ \,\beta \, = {\text{ arctangent }}\left( {{\text{Y }}/{\text{ X}}} \right)$$
其中：
$$^\circ {\text{X }} = {\text{ cos}}\left( {\varphi {\text{B}}} \right) \, \times {\text{ sin}}\left( {\Delta {\text{L}}} \right)$$
$$^\circ {\text{Y }} = {\text{ cos}}\left( {\varphi {\text{A}}} \right) \, \times {\text{ sin}}\left( {\varphi {\text{B}}} \right) \, - {\text{ sin}}\left( {\varphi {\text{A}}} \right) \, \times {\text{ cos}}\left( {\varphi {\text{B}}} \right) \, \times {\text{ cos}}\left( {\Delta {\text{L}}} \right)$$
φA和φB分别是起点和终点的纬度。ΔL是经度差。
每个计算出的方位角被分类到以下方向之一：
337.5° ≤ β < 22.5° → 北（N）；
22.5° ≤ β < 67.5° → 东北（NE）；
67.5° ≤ β < 112.5° → 东（E）；
112.5° ≤ β < 157.5° → 东南（SE）；
157.5° ≤ β < 202.5° → 南（S）；
202.5° ≤ β < 247.5° → 西南（SW）；
247.5° ≤ β < 292.5° → 西（W）；
292.5° ≤ β < 337.5° → 西北（NW）
这种方法使得能够标准化和一致地解释每年每个ASFV遗传组的方向性移动模式。
**2019年至2024年间野猪中ASF的发生状况**
2019年10月，ASF首次在韩国延川的野猪中被检测到[3]（图1）。随后，ASF在野猪中的爆发持续到2024年。病例最初集中在北部地区，如江原道和京畿道，并逐渐扩展到南部地区，包括庆尚北道和釜山（图1A）。ASF病例主要在1月至3月期间报告，2020年3月和2022年3月达到高峰（图1B）。在所有年份中，ASFV阳性病例的数量在6月至10月之间显著下降（图1B）。
**韩国野猪中非洲猪瘟（ASF）病例的分布（2019–2024年）**
（A）按年份划分的非洲猪瘟病毒（ASFV）在野猪中的地理分布。每个彩色点代表检测的时间和位置：浅蓝色代表2019年，紫色代表2020年，绿色代表2021年，黄色代表2022年，橙色代表2023年，红色代表2024年。
（B）热图显示了每年和每月ASFV阳性野猪病例的数量。颜色越深表示阳性病例数量越多。
**B646L（P72）：基因分型标记**
第一个基于PCR扩增和Sanger测序B646L（p72）可变C末端的ASFV基因分型协议建立于2002年[11]。B646L的部分测序将ASFV菌株分为26个全球公认的基因型[36, 37]。2019年至2024年间，在韩国收集了4209个ASFV阳性野猪样本，并使用B646L分析进行了连续的分子监测。所有地区的基因分型覆盖率超过95%，其中京畿道的覆盖率最高（98.2%），釜山的覆盖率最低（92.0%）（表2）。所有ASF爆发地区，包括江原道、京畿道、忠清北道、庆尚北道、大邱和釜山，都被确认与基因型II相关（图2A）。此外，使用2019年至2024年间从韩国野猪中收集的代表性ASFV分离株的全基因组序列进行的系统发育分析证实，所有韩国菌株与全球基因型II参考菌株聚类在一起（图2B）。
**I73R/I329L：亚基因分型标记**
I73R和I329L之间的基因间区域（IGR）的序列比对揭示了在韩国野猪中循环的三种不同的IGR类型：IGR I、IGR II和IGR III（图3A）。这些变异在串联重复序列（TRS）的数量上有所不同，IGR I包含一个重复单元，IGR II包含两个单元，IGR III包含三个单元。与国际参考菌株的比较表明，韩国的IGR变异具有与2007/1年在乔治亚州和越南分离株中报告的相同TRS结构模式。
**ASFV基因间区域（IGR）变异的时空分布和年度比例**
（A）2019年至2024年间在韩国野猪中检测到的ASFV基因型的空间分布。绿色点表示确认的基因型II病例。
（B）使用ASFV菌株的全基因组序列构建的系统发育树。彩色条代表基因型分类：绿色代表基因型II（GII），橙色代表基因型I（GI），黄色代表基因型X（GX），蓝色代表基因型IX（GIX）。红色星号表示从韩国野猪中获得的ASFV序列（本研究）。
**MGF 360-1L：韩国野猪中的独特亚基因分型标记**
2020年，在从韩国感染ASF的野猪中分离出的病毒中发现了MGF 360-1La第106位氨基酸位置的变异。在该位置具有亮氨酸（L）的菌株被归类为野生型（WT），而具有脯氨酸（P）的菌株被归类为突变型（MT）[5]。在这项研究中，我们使用MGF 360-1La中的L106P替换作为遗传标记，因为它仅在韩国野猪中被报道。使用这个标记，我们调查了2019年至2024年ASFV的空间分布。年度趋势显示，突变型首次在2020年被检测到，占所有病例的6.2%。其比例在2021年显著增加到22.2%，2022年增加到13.4%。然后在2023年下降到5.7%，2024年下降到8.7%，而野生型在整个研究期间一直是主要变异（图4B）。区域趋势表明，突变型在江原道（20.7%）和忠清北道（14.7%）中最常被检测到，而在京畿道（0.2%）和庆尚北道（1.5%）的比例非常低。在釜山和大邱没有发现突变型病例。这些发现表明，突变型具有地理限制的分布，主要发生在韩国的中部和东北部地区（图4C）。
**MGF 505-9R/10R：亚基因分型标记**
基于MGF 505-9R/10R区域内的串联重复序列变异，基因型II ASFV分离株被分为八个亚基因型（MGF-1至MGF-8）[24]。使用这一已建立的分类框架，我们分析了2019年至2024年间在韩国野猪中检测到的ASFV，以表征循环变异的空间和时间动态。在分布图中，MGF-1显示为蓝色，MGF-5显示为黄色。MGF-1主要分布在北部中心地区，包括靠近朝鲜边界的地区，而MGF-5的分布范围更广，延伸到中部和南部地区（图5A和5B）。年度趋势显示，2019年仅检测到MGF-1（100%），而MGF-5首次在2020年被识别，占病例的0.6%。其比例随后在2021年增加到12.0%，2022年增加到55.8%，2023年增加到71.7%。到2024年，MGF-5成为主要类型，占所有样本的89.5%（图5C）。区域分析还显示了MGF-1和MGF-5的分布差异（图5D）。在江原道，MGF-5占病例的28.3%，而在京畿道的比例非常低，仅为0.5%。相比之下，中部和东南部地区的MGF-5比例显著较高，忠清北道达到46.4%，庆尚北道达到93.0%，釜山达到95.2%，大邱达到95.3%。这些发现表明，MGF-5变体的传播在韩国东南部地区越来越集中。图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：韩国野猪中ASFV亚型MGF-1和MGF-5的时空分布。(A和B) 2019年至2024年间，ASFV亚型MGF-1（A，蓝色）和MGF-5（B，黄色）在韩国的地理分布。(C) MGF-1和MGF-5亚型在所有ASFV阳性野猪病例中的年度比例。(D) 主要省份中MGF-1和MGF-5亚型的区域分布。通过分子标记组合识别的ASFV基因簇的地理分布。为了将ASFV分离株分类为不同的基因簇，我们分析了四个分子标记的组合：B646L基因型、IGR变异、MGF 360-1La位置106处的氨基酸残基以及MGF 505-9R/10R区域的TRS。每个簇由这些标记的独特组合定义，如表3所总结，并在表4中提供了这些组合的示意图，以清晰地展示这四个标记如何共同区分本研究中识别的六个簇。2019年至2024年间，根据分子标记，检测到的野猪ASFV阳性病例被分为六个基因簇（簇1、1.1、1.2、2、3和4），并在地图上可视化了它们的地理分布（图6）。簇1（橙色）主要在靠近朝鲜边界的京畿道北部和江原道被发现，是韩国ASFV疫情早期阶段的主要簇。簇1.1（粉色）和簇1.2（黄色）分别在京畿道北部被识别为IGR I和IGR III。每个簇分别只在一个（簇1.1）和三个（簇1.2）病例中被检测到，表明检测频率较低（左插图）。此后没有再发现属于这些簇的病例。簇2（绿色）的特征是MGF 360-1La中的独特氨基酸替换（L106P），主要在忠清北道中部和忠清北道北部被发现，表明这是一个传播途径有限的新变体谱系。簇3（蓝色）在MGF 505-9R/10R区域具有MGF-5类型的串联重复结构，分布在忠清北道东部、忠清北道和庆尚北道。这种模式可能表明了一个正在出现并积极传播的新谱系。簇4（红色）与簇1.2共享IGR III变异；然而，它表现出不同的分子标记组合，并且地理上仅限于庆尚北道东部，表明它代表了一个遗传上独立的谱系。表3：用于定义ASFV基因簇的关键分子标记组合。全尺寸表格。表4：用于定义ASFV基因簇的关键分子标记组合的示意图。全尺寸表格。图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：根据分子标记分类的ASFV簇的空间分布。地图显示了基于分子标记B646L、IGR、MGF 360-1La和MGF 505-9R/10R定义的六个ASFV基因簇（簇1、1.1、1.2、2、3和4）在野猪中的空间分布。每个点代表一个确认的ASF病例，并按簇进行颜色编码：簇1（橙色，n=1340），簇1.1（黄色，n=1），簇1.2（粉色，n=3），簇2（绿色，n=330），簇3（蓝色，n=1299），簇4（红色，n=40）。2019-2024年间韩国野猪中ASFV基因簇的估计传播路线。2019年至2024年间野猪中的ASF病例基于分子聚类进行分析，揭示了每个簇的明确传播方向（图7）。簇1（橙色）表现出明显的向南传播。据推测，它起源于靠近朝鲜边界的京畿道北部和江原道北部地区，并逐渐扩展到忠清北道和庆尚北道北部等内陆地区。这个簇似乎在韩国ASFV传播的早期阶段形成了主要的传播路线。簇2（绿色）仅限于忠清北道中部和忠清北道北部，没有证据表明其传播超出这些区域，表明其传播模式是局部的。簇3（蓝色）起源于忠清北道北部，随后向东南方向传播到庆尚北道中部。这个簇与其他簇的地理重叠有限，被解释为一个具有独立传播途径的独特谱系。此外，自2022年以来其检测频率有所增加，表明它代表了一个正在中部-南部内陆地区逐渐扩大的主导簇。簇4（红色）最初在庆尚北道东部沿海地区被检测到，后来向内陆地区西部传播。图7：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：2019-2024年间在野猪中识别的ASFV分子簇的地理传播模式。该地图展示了2019-2024年间在野猪中检测到的四个主要ASFV分子簇的空间分布和推断的传播方向。簇1、2、3和4在地图上分别用橙色、绿色、蓝色和红色表示。讨论：ASFV对全球养猪业和野生动物健康构成了严重威胁，并且持续传播。ASF于2019年10月首次在韩国延川的野猪中被检测到，疫情已经持续了大约五年（图1）。这些持续的疫情对该国的养猪业和野生动物健康造成了重大损害。尽管ASFV（ASF的致病因子）被认为是一种相对稳定的DNA病毒[1]，但先前的研究报告称，在特定基因组区域会发生突变，如TRS的变化、氨基酸替换以及小的插入或删除[38]。此外，最近的研究越来越多地报告了涉及基因型I和基因型II病毒的重重组ASFV菌株的出现[39, 40]。这些突变是亚型分型和簇区分的重要分子标记，并且对于流行病学调查非常有用[24, 41]。因此，除了简单的ASF诊断之外，基因组监测越来越被认为是追踪其传播路线和起源的重要工具。在这项研究中，选择了B646L（p72）、IGR、MGF 360-1La和MGF 505-9R/10R等基因标记组合来定义ASFV的基因簇。这种方法使我们能够重建ASFV传播的时间和空间模式，并推断可能的传播方向，从而增强我们对ASFV传播动态的理解，支持潜在病毒入侵或重新出现的解释，并为有效的控制策略提供信息。ASF起源于非洲，随后在全球范围内传播[42]。因此，追踪不同国家之间的疫情联系并确定引入途径至关重要[43]。病毒基因分析是此类流行病学调查的关键工具。在各种标记中，B646L（p72）已成为诊断的重要标记，并且是区分ASFV基因型的代表性分子标记。Bastos等人根据p72序列对ASFV基因型进行了分类，现在报告称该病毒包含多达26个基因型[11, 37, 44]。在这项研究中，2019年至2024年间在韩国野猪中检测到的所有ASFV菌株都被鉴定为基因型II（图2）。这一发现表明，自2019年ASFV首次引入韩国以来，同一基因型一直在持续传播，表明国内疫情是由单一基因型维持的。虽然可以使用p72对ASFV进行基因分型，但这种方法在区分同一基因型内的谱系方面分辨率有限。因此，对EP402R（CD2v）、基因间区域（IGR）和B602L内的中心可变区域（CVR）等可变区域以及各种区域特异性独特标记的额外分析可以更详细地捕捉遗传多态性，并允许更精确地重建循环病毒株之间的系统发育关系；这些分子标记已被用作流行病学追踪和系统发育分析的重要工具[29, 41, 46]。然而，尽管在韩国野猪的ASFV变体分子监测中同时监测了EP402R和B602L-CVR和IGR，但在来自韩国的基因型II ASFV分离株中尚未在这些区域检测到核苷酸变异。位于I73R和I329L基因之间的10-bp TRS已被确立为基因型II病毒的分型标准标记。在参考基因组Georgia 2007/1（FR682468.2）中，I73R和I329L之间的IGR包含两个10-bp TRS拷贝，被分类为IGR I。2014年，Gallardo等人在来自乌克兰、白俄罗斯、立陶宛和俄罗斯的ASFV分离株中发现了额外的TRS插入，随后被指定为IGR II。随后，在欧洲、俄罗斯和亚洲也报告了IGR I和IGR II变异体，IGR II在2014年后成为欧盟的主要亚型[20, 24, 47, 48, 49]。IGR III以四个TRS重复为特征，2019年首次在中国广西省被识别，2022年在越南也报告了额外的IGR III病例[50, 51]。2019年首次引入韩国的ASFV被鉴定为IGR II，随后成为该国流行的主要IGR变异体。2019年和2020年在坡州分别检测到一个IGR I和三个IGR III病例；然而，此后IGR II成为主导类型。2023年11月，IGR III在清松和浦项重新出现[52]，随后在附近地区的检测引发了对该亚型重新传播的担忧（图3）。这些发现表明有可能再次引入，尽管不能排除病毒突变或多重因素的影响。在韩国野猪的ASFV菌株中，已经识别出MGF 360-1La位置106处的氨基酸替换，其中亮氨酸被脯氨酸取代，这被认为是仅在韩国报告的独特标记[5]。这种突变首次在2021年出现在江原道北部地区，2022年观察到的频率最高，并且一直持续存在。这种突变可能是追踪韩国ASF疫情谱系多样化和区域传播途径的独特分子标记。Gallardo首次提出分析MGF 505-9R/10R内的TRS作为传统类型之外的新标记[53]。这个标记有助于将MGF组分类为1至8。在参考基因组Georgia 2007/1以及俄罗斯和大多数欧洲地区检测到的ASFV菌株中，病毒主要属于MGF-1，而在某些地区也检测到了其他MGF组[24]。通过持续的全基因组监测，我们首次在2020年在京畿道北部识别出MGF 505-9R/10R的新变体。2019年最初引入和传播的病毒属于MGF-1；然而，2020年首次在该地区检测到MGF-5。随后，MGF-5的流行率稳步增加，并在2024年成为主导类型，占检测到的ASFV菌株的约90%（图6）。相比之下，2022-2023年间韩国国内养猪场的ASFV菌株属于MGF-1[48]。在欧洲，2017年在立陶宛的一头野猪中首次报告了MGF-5（MGF-V）变体[24]，最近在2023年的意大利罗马疫情波中描述了一种不同的MGF 505-9R/10R TRS变体，它似乎仅限于当地传播的基因型II谱系[29]。综合这些观察结果，表明MGF-5谱系在韩国野猪中的出现和扩展可能是独立发生的；然而，不能完全排除国际传播的可能性。当依赖单一基因标记进行ASFV的流行病学区分时，这是具有挑战性的；因此，通常采用多个分子标记来分类病毒组并分析其分布和传播模式[24, 41]。然而，一些标记在特定区域的变异很小或没有变异，限制了它们的流行病学分辨率，并表明标记组合应根据每个国家的区域背景进行定制[10, 54]。在韩国，2019-2024年间在野猪中识别的ASFV菌株使用标准基因型标记p72、亚型标记IGR、韩国特有的标记MGF 360-1La和最初在欧洲报告的MGF 505-9R/10R标记被分为六个簇（表3）。这六个基因簇在韩国野猪中的时空分布为了解ASFV基因型是如何引入和在该国传播的提供了重要线索。同时，最近的空间建模研究强调了ASF风险的时空异质性以及围栏对韩国野猪的影响[55, 56]。这些发现表明，本研究中提出的多标记基因簇分析可以作为现有空间风险评估的补充工具。基因簇1-3似乎起源于京畿-江原地区的西北部，并随后扩散到相邻的内陆地区，而基因簇4最初在庆北省的东部沿海地区被发现，然后向内陆扩散。综合来看，这些不重叠的地理模式表明，观察到的遗传多样性更可能是由于已经多样化的基因型II ASFV谱系多次引入韩国不同地区后，经过局部传播而形成的，而不是单一家养谱系随时间逐渐进化所致。相比之下，基因簇2虽然最初与基因簇1-3在同一京畿-江原北部地区被发现，但其分子标记组合迄今为止仅在韩国野猪中被报道过。该基因簇在2021年左右被最频繁地检测到，当时全国范围内ASFV阳性的野猪数量达到峰值。这种时间和空间的集中模式可能表明，在该地区，ASFV的长期和强烈传播导致了一定程度的自然多样化。总体而言，这项研究表明，韩国野猪中的ASFV流行始于2019年基因型II病毒的初次引入，随后出现了多个亚型和基因簇，其特征是IGR和MGF区域存在变异。这些基因簇的时空分布表明，最初引入的谱系在韩国内部的逐渐多样化以及来自外部来源的重复引入可能共同导致了观察到的遗传异质性。此外，为了更精确地理解基于多个分子标记的基因簇级传播动态，未来的研究应将年度和特定基因簇的传播模式与各种环境变量（如季节性、野猪栖息地密度以及地形或生态因素）结合起来。由于部分基因分析可能无法检测到罕见或新出现的变异，因此需要使用全基因组测序进行持续突变监测。因此，结合多标记分子分析和全基因组测序的监测策略将在早期发现新出现的变异、阐明传播动态以及加强未来的控制策略方面发挥关键作用。
