摘要
本研究旨在利用光学相干断层扫描血管成像（OCT-A）技术，评估轻度阿尔茨海默病（AD）患者、因AD导致的轻度认知障碍（MCI）患者以及健康对照组患者的视网膜结构和血管变化，并探讨其作为早期疾病检测非侵入性生物标志物的潜在作用。2020年12月至2024年12月期间，连续纳入了前往IRCCS Neuromed阿尔茨海默病单元就诊的受试者。MCI和轻度AD的诊断依据NIA–AA标准，并结合神经心理学评估、脑部MRI和淀粉样蛋白PET成像结果进行确认。健康对照组经过认知评估，且无神经系统或眼部疾病。所有参与者均接受了全面的眼科检查及使用Canon OCT HS 100 4.8系统进行的OCT/OCT-A成像检查。研究分析了视网膜神经纤维层（RNFL）、神经节细胞层（GCL）、内丛层（IPL）、黄斑区及黄斑旁血管密度以及黄斑无血管区（FAZ）的面积和内径。组间比较采用带Bonferroni校正的方差分析（ANOVA），年龄因素通过协方差分析（ANCOVA）进行调整。结果显示，MCI和轻度AD患者的视网膜血管变化显著高于健康对照组，尤其是FAZ内径显著增大，深层毛细血管丛密度降低，这些差异在年龄校正后仍具有统计学意义。MCI组与健康对照组在RNFL或GCL–IPL厚度上无显著差异。OCT-A技术揭示了生物标志物确认的MCI和轻度AD患者的早期视网膜血管变化，FAZ内径的增大可能成为一种有前景的非侵入性视网膜生物标志物，需在更大规模的诊断队列中进一步验证。
1. 引言
阿尔茨海默病（AD）是导致痴呆最常见的原因之一。目前估计约有4680万人患有AD，预计到2050年这一数字将增至1.31亿[1]。近年来，研究人员广泛探索新的诊断生物标志物，以期在疾病早期阶段实现诊断，从而及时实施潜在的干预措施[2, 3]。目前AD研究中最常用的生物标志物包括脑部淀粉样蛋白PET[4]、脑脊液（CSF）中的β-淀粉样蛋白（Aβ）和磷酸化tau（p-Tau）及总tau（t-Tau）水平。然而，这些检测方法复杂且具有侵入性，在临床实践中难以实施。当前的研究目标是寻找新的特异性标志物，以实现AD的早期诊断，尤其是在患者仅有轻微症状且仍能自主生活的阶段[5]；理想情况下，这些标志物应具有非侵入性和易于监测的特点[6]。近年来越来越多的研究表明，AD不仅影响大脑组织，还会系统性地影响视网膜[7]，甚至在疾病早期阶段也是如此[7, 8, 9]。多项研究显示，轻度认知障碍（MCI）患者的黄斑体积普遍低于健康对照组[10, 11, 12, 13]，其视网膜厚度介于AD患者和健康对照组之间[10, 11]。不过这一观点仍有争议，部分最新研究认为视网膜厚度可能因疾病早期阶段的代偿机制而动态变化[14, 15]。研究还发现，视网膜对有毒蛋白质Aβ和tau的积累具有类似反应[15, 16]；此外，视网膜可能从淀粉样前体蛋白（APP）产生Aβ，后者通过神经突触从大脑皮层经视神经轴突运输到视网膜[17, 18]，形成与脑部淀粉样斑块类似的沉积物[7, 8]。Aβ和tau在视网膜的积累会导致视网膜神经节细胞层（RGCL）萎缩和视网膜神经纤维层（RNFL）损伤，以及视神经轴突的丢失[19]。光学相干断层扫描（OCT）是一种高分辨率的诊断工具，能够无创地识别视网膜病变[20]。随着技术的快速发展，现有OCT设备可检测视网膜各层的退化情况，包括RGCL和RNFL（属于内视网膜层[21]）。AD患者存在所谓的淀粉样脑血管病，其特征是动脉壁中的Aβ沉积，Aβ对脑动脉具有特定的收缩作用，导致血流减少[15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]。经颅多普勒和灌注SPECT检测显示，AD患者的血流减少在组织学上表现为微血管密度降低、动脉迂曲、静脉胶原变性、内皮通透性增加及神经退行性变[20, 21, 22, 23]。视网膜和大脑同样具有高代谢率。首次使用激光多普勒流量计对轻度/中度AD患者进行视网膜血流动力学研究时，发现其整体视网膜血流显著低于健康对照组[22]，后续研究也证实了这一发现[23]。近年来，将血管成像技术（OCTA：光学相干断层扫描血管成像）应用于OCT，观察到AD患者的视网膜微循环紊乱和反复出现的血管变化[24, 25]，如视网膜血管结构稀疏[23, 26, 27]和黄斑无血管区（FAZ）扩大[6, 7, 8]；这些变化在AD前期或MCI患者中同样存在[28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]。
2. 材料与方法
所有前往IRCCS Neuromed（意大利波齐利）阿尔茨海默病单元就诊并被诊断为MCI或轻度AD的受试者被纳入病例组，其家庭成员或配偶作为健康对照组。研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得Neuromed研究所伦理委员会的批准（方案代码11/20；2020年11月16日）。所有参与者均签署了知情同意书。研究时间为2020年12月至2024年12月。所有患者均接受了脑部MRI检查以评估脑萎缩情况并排除其他脑部疾病；同时进行了脑部淀粉样蛋白CT-PET检测以确认淀粉样蛋白负荷，并进行了全面的神经心理学评估。仅MMSE评分≥24的受试者被纳入MCI组，MMSE评分≥17的受试者被纳入轻度AD组。MCI和轻度AD的诊断均基于NIA-AA标准[10]。健康对照组也接受了认知评估，不符合认知纳入标准的受试者被排除。排除的主要标准包括：无提示后皮质萎缩的视觉症状（如偏瘫或皮质性失明）、视力在20/20至20/32之间、屈光不正超过4.50屈光度、眼压超过20 mmHg或C/D比值超过0.5（使用Goldmann压陷眼压计测量）、视神经盘倾斜或视神经盘周围萎缩等。此外，排除患有未控制的高血压、视网膜病变（如AMD、视网膜前膜、糖尿病微血管病变引起的黄斑孔）、接受过光凝治疗或其他视网膜干预、使用可能影响视网膜厚度测量的类固醇或利尿剂（如乙酰唑胺）的患者；以及正在接受葡萄膜炎或青光眼局部治疗、弱视或有神经眼科疾病史的患者；还有在入组前12个月内接受过白内障手术的患者。病例组和对照组均接受了双眼全面的眼科检查，包括视力测量、Goldmann压陷眼压计检查、散瞳后的眼底检查。检查项目包括黄斑OCT、视网膜神经纤维层（RFNL）和视网膜神经节细胞（RGCs）检测。同时进行了OCT-A检查，以评估表层血管丛（SVP）、深层毛细血管丛（DCP）及黄斑无血管区（FAZ）的密度。使用配备人工智能系统、OCT-Angio技术和流式融合技术的Canon OCT HS 100 4.8超宽SD OCT设备进行高清晰度OCT检查。该设备可连续多次处理同一区域，有效减少因患者配合不佳导致的伪影；软件自动分割全层视网膜图像，自动计算血管密度（VD）和FAZ面积。采集协议和流式融合技术有效减少了运动伪影（包括微动和大幅眼球运动引起的伪影）。OCT/OCT-A用于测量：视网膜神经纤维的厚度（以微米计，包括整体和各区域）、黄斑体积（以微米³计）、黄斑厚度（以微米计）、GCL+IPL层的细胞丢失百分比（按年龄和种族群体标准化）、黄斑及黄斑旁血管密度、SVP和DCP的血管化密度百分比、FAZ的面积和内径（以微米计）。
通过OCT/OCT-A收集的数据包括：
- 视网膜神经纤维的厚度（包括整体和各区域）；
- 黄斑体积（以微米³计）；
- GCL+IPL层的细胞丢失百分比（按年龄和种族群体标准化）；
- 黄斑及黄斑旁血管密度（表层和深层）；
- FAZ的面积和内径（以微米计）；
- 黄斑血管密度（VD）。
统计分析方面，连续变量以均值±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较后使用Bonferroni校正。当组间年龄存在显著差异时，对所有OCT-A参数应用了调整年龄的协方差分析（ANCOVA）。分类变量比较采用卡方检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。3 实验目的：本研究旨在使用Macular OCT评估并比较三组受试者（轻度AD、MCI和健康对照组）的RFN、GC和IP层，以及黄斑和黄斑周血管密度（VD），还有黄斑中心凹区（FAZ）的大小和直径。4 结果：共有140名参与者的280只眼睛被纳入研究（35名MCI患者，35名轻度AD患者，70名健康对照组；见表1）。正如预期的那样，健康对照组平均年龄稍小；因此，所有OCT-A比较结果都使用了根据年龄调整的ANCOVA进行分析。表1 显示了参与者的 demographic 和临床特征。与健康对照组相比，MCI和轻度AD患者的FAZ内径显著增大，尤其是在深层毛细血管丛（DCP）中。MCI和轻度AD患者的DCP内径平均值显著高于对照组（ANOVA p<0.001；Bonferroni事后检验p<0.001，无论是MCI vs HC还是AD vs HC；表2）。在表层血管丛（SVP）中，只有轻度AD患者的FAZ内径显著大于对照组（ANOVA p=0.001；事后检验p=0.001），而MCI组之间的差异没有达到统计学意义（p=0.093）。表2 显示了MCI、轻度AD患者和健康对照组中的SVP和DCP FAZ。MCI和轻度AD组的血管密度（VD）也有所降低。SVP的密度显著低于对照组（ANOVA p=0.002；Bonferroni检验p=0.007，AD vs HC；p=0.019，MCI vs HC）。DCP的密度下降更为明显，MCI和轻度AD组的值均显著低于对照组（ANOVA p<0.001；p<0.001，MCI vs HC；p=0.006，AD vs HC）。关于FAZ面积，仅在MCI和对照组之间的DCP中发现了显著差异（0.80 vs 0.67；p=0.038），而AD和对照组之间没有显著差异（p=1.000；表3）。表3总结了使用Canon OCT 100进行视网膜成像和视网膜图像分析的技术。在根据年龄使用ANCOVA调整所有分析后，DCP FAZ内径、DCP血管密度和DCP FAZ面积的差异仍然具有统计学意义，这证实了研究结果的可靠性。分别对右眼和左眼进行的分析得出了相似的结果，支持了数据集的内部一致性。完整的数值记录在表1和表2中，图形表示见图1和图2。图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。图3：健康受试者的密度和面积[直径，微米]。5 讨论：我们的研究表明，通过生物标志物确认的轻度阿尔茨海默病和轻度认知障碍患者在OCT-A上表现出早期视网膜血管改变，主要表现为黄斑中心凹区（FAZ）内径显著增大和深层毛细血管丛血管密度降低。这些变化在调整年龄后仍然具有统计学意义，并且没有伴随RNFL或GCL–IPL厚度的结构改变。先前的研究也报告了MCI或AD患者的FAZ扩大，尽管大多数分析集中在FAZ面积而非内径上[35,36,37]。我们的结果通过识别FAZ内径的显著差异进一步证实了这一点，这一参数可能比FAZ面积更敏感于早期微血管变化。在评估FAZ面积（mm²）时，MCI和轻度AD患者的值平均高于健康对照组，但在SVP或DCP中组间差异没有统计学意义。这些发现与之前的多项研究结果一致[14,15,16,17,18,19,20,21,22,29,36]。总体而言，关于FAZ面积的证据尚无定论，不同研究的结果存在异质性。此外，我们观察到MCI和轻度AD患者的FAZ内径（µm）显著增大（p<0.01），据我们所知，这之前尚未被报道，可能是一个更敏感的早期微血管变化指标。这种模式的生物学合理性得到了中央黄斑微血管稀疏概念的支持，这可以扩大FAZ轮廓[14, 29, 32, 33, 38]。这一机制也与我们在MCI组观察到的血管密度下降趋势相符（尽管没有统计学意义），表明在明显的结构损失之前已经发生了早期血管损伤。我们的SD-OCT系统配备了基于人工智能的图像分析模块，在视网膜测量方面表现出高可靠性。该设备使用精确的眼球跟踪系统（1/100秒的灵敏度）和对同一视网膜区域进行多次扫描（最多十次连续扫描），以大幅减少运动和顺应性相关的伪影。软件自动分割全层视网膜扫描，区分表层和深层血管丛以及外层视网膜结构。与先前的研究一致，我们的SD-OCT数据显示MCI患者和健康对照组之间的RNFL或GCL–IPL参数没有显著差异[12,13,14,15,16,17,18,19,24,37]。这支持了OCT-A检测到的早期微血管改变可能先于明显的结构神经退行性变性的观点。这些发现应结合研究的局限性来解读。尽管健康对照组接受了认知评估，但他们没有接受CSF或PET等生物标志物检测，这可能会引入一些误分类。此外，视网膜血管改变并非阿尔茨海默病所特有，也可能出现在其他眼科或神经退行性疾病中[20, 24, 25]。尽管存在这些局限性，我们的研究包括了迄今为止分析的最大样本量之一，并使用了具有高重复性的标准化成像协议。结果在年龄调整后以及左右眼分析之间的一致性进一步增强了我们发现的可靠性。未来的诊断性队列研究对于确定FAZ内径和血管密度改变在早期阿尔茨海默病中的敏感性、特异性和预测价值至关重要（图3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17和18）。图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。图5：FAZ内径的高斯分布。图6：Angio-OCT的图形分布。图7：ADF中的表层FAZ。图8：ADF中的深层FAZ。图9：FAZ内径的高斯分布。图10：Angio-OCT的图形分布。图11：AD表层血管丛密度（SVP）。图12：AD深层血管丛密度（DVP）。图13：MCI表层血管丛密度（SVP）。图14：MCI深层血管丛密度（DVP）。图15：MCI表层面积。图16：MCI深层面积。图17：AD表层面积。图18：AD深层面积。6 结论：我们的结果表明，所有通过生物标志物确认有淀粉样蛋白脑负担（淀粉样蛋白PET阳性）的MCI和轻度AD患者都表现出视网膜血管改变，其特征是FAZ扩大。观察到的较低血管密度与GCC和RFL厚度的变化无关。实际上，只有很少的MCI患者[5.55%]和更少的健康对照组[1.85%]显示出任何改变。我们观察到SVP和DCP中的血管密度降低，但组间没有显著差异。我们的发现表明，所有MCI和轻度AD患者都表现出一些特定的改变，如血管变薄和FAZ内径变宽，这可能作为AD的潜在生物标志物。目前可用于MCI和轻度AD的生物标志物，如PET或CSF，都是昂贵且具有侵入性的技术。我们的数据表明，通过OCT-A测量的FAZ扩大可能是一种非侵入性和经济可行的MCI和轻度AD生物标志物。进一步研究OCT-A评估和视网膜成像可以提供一种非侵入性工具，有助于及时识别AD。这些研究应采用诊断设计，而不是病例对照设计，因为病例对照设计会限制研究中对疾病患病率的了解，从而影响结果的有效性。因此，未来的诊断性研究应设计为队列研究，以探索这些标志物在其预期应用人群中的实际效用。
