近期基因5型日本脑炎病毒（genotype 5 Japanese encephalitis virus, G5 JEV）的出现再次引发公共卫生领域的关注。研究人员对G5 JEV亲本毒株XZ0934进行空斑试验分析时观察到两种 distinct 空斑形态，为探究这种表型异质性，采用单斑纯化技术分离获得两株病毒，分别命名为XZ0934-L（大斑）和XZ0934-S（小斑）。深度突变扫描结果显示，XZ0934-S株的E蛋白第138位存在氨基酸突变（E138K）。病毒滴度测定与空斑形态分析表明，XZ0934-L和XZ0934-S在BHK-21细胞中的滴度分别为107.06PFU/mL和107.35PFU/mL，空斑直径分别为0.87±0.12 mm和0.38±0.08 mm。尽管两株病毒在所研究的6种细胞系中均诱导细胞病变效应（cytopathic effect, CPE），但在N2a细胞中XZ0934-S引起的CPE显著弱于XZ0934-L。空间建模预测E138K替换未显著改变E蛋白的整体构象。转录组分析显示，不同基因型JEV感染N2a细胞后诱导的宿主基因表达谱存在显著差异，其中XZ0934-S株引起的转录扰动最轻微，其对调控通路的扰动程度明显弱于XZ0934-L株。既往研究提示E138K突变可降低JEV神经毒力，本研究首次对G5 JEV中的E138K突变体进行了全面的体外表征。XZ0934-S突变株因具有小斑表型和较低的转录影响，是进一步疫苗开发的潜在候选株，未来需在动物模型中严格评估其安全性、遗传稳定性和免疫原性。
研究背景与意义
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）属于黄病毒科（Flaviviridae）正黄病毒属（Orthoflavivirus），基因组为单股正链RNA，编码3种结构蛋白（C、prM、E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5），可分为5种基因型（G1–G5）。全球JEV流行呈现动态变迁特征：2000年前G3为优势基因型，之后G1逐渐取代G3成为亚洲流行区主导基因型；G2、G4分别分布于澳大利亚、巴布亚新几内亚及印尼东部；G5曾在印尼、中国、韩国被检出，近年韩国自然流行的JEV基因型向G5转变，中国也从蚊媒中分离到G5毒株，提示该基因型可能构成新的公共卫生威胁。现有疫苗对G5 JEV的保护效力有限，亟需针对该基因型的候选疫苗开发。2009年研究人员从西藏林芝库蚊中分离到G5 JEV毒株XZ0934，早期传代中观察到空斑形态异质性，本研究旨在解析该异质性的分子基础与生物学意义，为G5 JEV致病机制研究与疫苗开发提供依据。该研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。
关键技术方法
研究使用实验室保存的G1（NX1889）、G3（P3）、G5（XZ0934）JEV毒株，以及BHK-21、N2a、Vero、C6/36、PK-15、DF-1共6种细胞系。核心技术包括：单斑纯化分离表型差异毒株，空斑试验测定病毒滴度与生长动力学，全基因组测序与下一代测序（next-generation sequencing, NGS）鉴定突变位点，AlphaFold 2.0进行E蛋白三维结构建模，转录组测序（RNA-seq）分析宿主基因表达变化，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析差异表达基因的功能通路，以及跨基因型E蛋白E138位点的序列保守性分析（基于NCBI GenBank中357条代表性序列）。
研究结果
3.1 XZ0934株早期分离物的异质性
XZ0934原始分离物在BHK-21细胞中呈现两种 distinct 空斑形态，NGS测序发现其与参考株在3个氨基酸位点存在差异，提示存在遗传异质性。
3.2 XZ0934-L与XZ0934-S的单斑纯化过程
经4轮单斑纯化后获得遗传稳定的两株病毒：XZ0934-L为大斑株，全基因组仅2个无义突变；XZ0934-S为小斑株，在第1389位核苷酸发生G→A替换，导致E蛋白第138位谷氨酸（E）变为赖氨酸（K）（E138K突变），Sanger测序验证了该突变的纯合性。
3.3 病毒滴度测定与空斑大小分析
BHK-21细胞中各毒株滴度为：G1 NX1889 106.59PFU/mL、G3 P3 107.01PFU/mL、XZ0934-L 107.06PFU/mL、XZ0934-S 107.35PFU/mL。空斑直径：NX1889（1.18±0.16 mm）>P3（1.88±0.4 mm）>XZ0934-L（0.87±0.12 mm）>XZ0934-S（0.38±0.08 mm），XZ0934-S空斑最小。
3.4 两株G5 JEV在不同细胞系中的毒力与生长动力学比较
两株病毒均能在6种细胞系中复制并诱导CPE（细胞脱落、皱缩、碎裂、死亡），BHK-21细胞对感染最敏感（36 hpi出现CPE）；N2a细胞中XZ0934-S诱导的CPE显著弱于XZ0934-L。生长曲线显示：BHK-21细胞中XZ0934-S复制更快、峰值滴度更高；N2a细胞中XZ0934-L复制能力显著优于XZ0934-S；C6/36细胞中XZ0934-S感染后期复制水平升高；其余3种细胞中两株复制趋势相似，XZ0934-L略占优势。
3.5 G5 JEV E蛋白E138位结构分析与跨基因型E基因序列比较
E138K突变未显著改变E蛋白整体构象。跨基因型357条E基因序列分析显示，E138在所有基因型中高度保守，仅23条序列（6.40%）发生突变，其中21次突变为碱性氨基酸替换（K/R），6次已被证实为减毒变异株。G5与其他基因型的核苷酸同源性（77.37%–78.16%）显著低于G1–G4之间的同源性（82.57%–89.70%），提示G5进化背景独特，本研究首次在G5中发现E138K减毒相关突变。
3.6 不同基因型JEV感染N2a细胞的转录组特征
3.6.1 基因表达谱分析：转录组数据质量可靠，感染组与对照组基因表达分布符合典型正态分布，病毒感染引起系统性转录改变。
3.6.2 不同基因型JEV诱导的转录组特征比较：主成分分析（principal component analysis, PCA）显示各感染组转录谱明显分离，XZ0934-S组最接近对照组。差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）数量：XZ0934-L组最多（2906个，1160个上调、1746个下调），其次为NX1889组（2630个）、P3组（1061个），XZ0934-S组最少（134个，52个上调、82个下调）。维恩图显示各组特异性差异基因占比高，共同差异基因极少（仅3个共同上调、14个共同下调）。
3.6.3 差异表达基因的KEGG通路富集分析：XZ0934-L与NX1889感染显著扰动多条通路，P3感染仅影响少数通路，XZ0934-S感染未富集到显著通路。上调通路中，NX1889与XZ0934-L富集核糖体、COVID-19疾病、帕金森病、神经退行性变通路、自噬、铁死亡、溶酶体等细胞应激相关通路；P3仅富集真核生物核糖体生物发生、氨基酸生物合成、COVID-19疾病、核糖体通路。下调通路中，XZ0934-L显著扰动38条通路（含Fc γR介导吞噬作用、阿尔茨海默病、帕金森病等免疫调节与神经退行性疾病通路）；NX1889下调通路集中于免疫应答与神经功能（T细胞受体TCR、Toll样受体TLR信号通路）；P3与XZ0934-S无显著下调通路。所有毒株共同上调基因显著富集“核糖体”通路（提示病毒劫持宿主翻译机器），共同下调基因富集“自噬”及相关信号通路（提示抑制宿主天然免疫清除）。毒株特异性通路显示：NX1889独特上调神经退行性疾病通路（脊髓小脑共济失调、帕金森病）；XZ0934-L独特诱导线粒体功能障碍与内质网应激（下调氧化磷酸化、上调内质网蛋白加工）；P3特异性触发凋亡通路。
讨论与结论
讨论部分指出，E138位于E蛋白结构域I与II界面的铰链区，该位点突变是SA14-14-2减毒活疫苗株的减毒机制之一，G1/G3中E138替换为碱性氨基酸可降低神经毒力。本研究首次在G5中发现E138K突变，其未改变E蛋白整体构象，但XZ0934-S在N2a细胞中转录扰动最轻，与减毒表型一致。转录组结果揭示了不同基因型JEV诱导宿主反应的异质性：G5 XZ0934-L与G1 NX1889诱导广泛的细胞应激与神经病理相关通路激活，对应较强的CPE；XZ0934-S仅引起微弱转录改变，与减毒特征吻合。研究同时提示，现有G5流行病例虽少，但XZ0934-L的强转录扰动能力提示其潜在致病风险不应低估。
结论部分明确：通过单斑纯化获得的G5 JEV小斑突变株XZ0934-S携带E138K突变，在N2a细胞中生长能力较弱，诱导的宿主转录扰动显著低于XZ0934-L与强毒株NX1889，转录谱接近疫苗株P3，且具有与SA14-14-2一致的减毒关键位点。这些初步证据表明该株是潜在的疫苗候选株，但其遗传稳定性、安全性、免疫原性与保护效力仍需在动物模型中全面评估。
