固相肽合成（SPPS）在很大程度上依赖于有害溶剂，如N,N′-二甲基甲酰胺（DMF），用绿色溶剂替代这些溶剂比预期的更具挑战性。目前，二甲基磺氧化物（DMSO）或N-丁基吡咯烷酮（NBP）与其他溶剂的二元混合物取得了最佳结果。由于DMSO和NBP的沸点很高，这些溶剂混合物很难回收利用。理想情况下，用于SPPS的溶剂或溶剂混合物应该具有适合回收利用的沸点，同时不会消耗过多的能量。在这里，我们开发了一种新的可膨胀的大孔聚苯乙烯（SMPS）树脂，使得在更环保、更可回收的溶剂系统中进行SPPS成为可能。这种SMPS树脂具有6%的-divinylbenzene交联度和大孔结构，在包括乙腈（MeCN）、乙酸乙酯（EtOAc）、2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）以及EtOAc与MeCN的混合物、三乙基磷酸酯（TEP）和甲苯（Tol）在内的多种单一和二元溶剂中表现出良好的膨胀性能。通过合成三种复杂度递增的模型肽来评估其性能：Leu-enkephalin、一种十肽类似物和一种afamelanotide类似物。在50°C时，几种替代溶剂系统的表现与DMF相当或更优，其中MeCN和EtOAc对于较短序列的肽表现优异，而二元混合物对于较长肽则更为优越。特别是EtOAc–Tol（3:1）混合物为afamelanotide类似物提供了最佳的粗品纯度，在优化脱保护和偶联条件后，纯度达到了91%。重要的是，这种溶剂混合物可以通过蒸馏回收，从而将过程质量强度（PMI）从3206降低到1137，相当于溶剂使用量减少了大约65%。这些结果表明，将SMPS树脂与可回收的二元溶剂结合是一种有前景的策略，可以在不牺牲合成效率的情况下提高SPPS的可持续性。
1. 我们正在解决绿色肽合成中最重要的未满足需求之一，即减少溶剂消耗。
2. 通过结合一种新的树脂（固体支持）和二元溶剂的概念，我们能够回收溶剂并将过程质量强度（PMI）降低了60%。
3. 这一策略可以在研究和工业规模上以吨级进行，从而节省溶剂。
引言
在过去的几年里，肽已经从主要的生化工具发展为最重要的活性药物成分（APIs）之一。从化学角度来看，可以识别出三类主要的治疗性肽：（i）含有亲脂侧链的长肽，主要针对代谢紊乱；（ii）含有非天然氨基酸的（生物-三环）肽，主要用于肿瘤学；（iii）用作放射配体的二硫键连接环肽。主要受到第一类肽的推动，全球肽产量已经增长到几年前难以想象的水平。同时，社会意识的提高和日益严格的监管要求加剧了对更可持续制造过程的需求。这种趋势推动了需要依靠更温和的试剂、最小化溶剂消耗，并能够在循环经济框架内实现溶剂回收和再利用的肽合成方法。对绿色肽合成的迫切需求导致了定量可持续性指标的广泛采用。其中，过程质量强度（PMI）是用于评估合成过程的材料足迹和环境影响的常用参数。然而，迄今为止，溶剂回收的努力还很有限。部分原因是常用溶剂的高沸点使得回收过程能耗高，这可能会抵消其环境效益。尽管如此，当实施溶剂回收时，应相应地调整PMI，如公式（2）所示。PMI计算为所有输入材料（试剂、溶剂和辅助物质）的总质量除以纯化产品的质量。除此之外，还采用了一个经过回收调整的指标（PMIr），即在标准化之前从总输入中减去回收的溶剂质量。
寻找新的溶剂主要集中在与凝胶型聚苯乙烯（PS）树脂兼容的溶剂上，因为它们在市场上最为常见，具有良好的载能力且价格适中。使用其他树脂（如基于聚乙二醇（PG）的树脂）虽然能适应更广泛的溶剂，但缺点是功能化程度低且价格较高。在这种情况下，只有N-丁基吡咯烷酮（NBP）可以作为N,N′-二甲基甲酰胺（DMF）的唯一替代品。然而，NBP也是一种酰胺类溶剂，预计在不久的将来会受到一些监管限制。在评估了多种单一溶剂系统后，发现需要二元溶剂混合物才能在SPPS中实现 acceptable 的性能。随后对传统聚苯乙烯（PS）树脂进行的广泛筛选表明，通常使用1%或2% DVB交联的二元系统得到了广泛采用：乙酸乙酯（EtOAc）与二甲基磺氧化物（DMSO）或N-丁基吡咯烷酮（NBP）的组合。然而，DMSO和NBP的沸点都很高，不易回收，限制了它们的可持续性。因此，开发替代溶剂或溶剂系统需要评估不同的固体支持物。在之前的工作中，我们引入了两种刚性、不可膨胀的支持物——大孔聚丙烯酸酯树脂和硅基树脂——它们由于结构特性，能够使用替代溶剂并同时减少溶剂消耗。在本研究中，我们提出使用可膨胀的大孔聚苯乙烯（SMPS）树脂作为补充策略，以在可回收溶剂系统中实现SPPS，从而摆脱对高沸点极性非质子溶剂的依赖。
SMPS树脂是使用一种新的专有技术（已申请专利）开发的，旨在减少在DMF中的膨胀，同时在其他与标准SPPS树脂不相容的溶剂中允许膨胀（见图1）。这些树脂基于1%或2%的DVB交联，通常按图1的步骤制造：首先混合苯乙烯和DVB，然后进行氯甲基化步骤。氯甲基化步骤是在树脂中引入功能基团的步骤。随后通过Gabriel反应将Cl基团转化为氨基基团。形成的树脂具有很高的膨胀性，被称为凝胶型树脂。图1展示了这一过程。
典型的1%交联凝胶型聚苯乙烯树脂和通过Fmoc-RinkAmide连接器功能化的6%交联SMPS树脂的制造过程比较。新开发的SMPS树脂使用了3种不同的单体（见图1）：苯乙烯、divinylbenzene和4-vinylbenzyl chloride。为了达到特定的孔隙率和较低的膨胀性，DVB的用量增加到了divinylbenzene的6%，并使用了孔隙生成剂。孔隙生成剂的作用是提供孔隙率和功能基团的 accessibility。在悬浮聚合后清洗孔隙生成剂。所得到的聚合物进一步通过引入间隔臂进行改造，引入了亲水性，并封闭了树脂中不可接近的微孔区域中的未反应基团。这样获得的氨基甲基（AM）树脂的浓度目标为0.62 mmol g−1，可用于本研究中使用的Fmoc-RinkAmide策略。这种专有技术非常灵活，可以使用不同的间隔臂，如脂肪族（C2或C6）、苯基或PEG来制造不同类型的疏水性。在本研究中，我们使用了C6脂肪族间隔臂。大孔结构的优势还在于提高了化学稳定性，因此可以在更广泛的有机溶剂中应用，包括绿色溶剂，因为SMPS在这些溶剂中也会表现出一定的膨胀性（见图2）。最经典的凝胶型PS树脂（1-2% divinylbenzene）具有平滑、非孔性的结构，其性质会根据所使用的溶剂而变化，而SMPS树脂则表现出大孔结构，其特征是在扫描电子显微镜（SEM）图像中可以看到连接通道（见图2a）。大孔树脂的特征是孔隙率的高斯分布，如图2b所示。在SMPS的情况下，大多数孔径范围在25–160纳米之间，如汞侵入法测得的孔径分布曲线所示（见图2b）。
聚苯乙烯基树脂的形态和孔隙率特性及其在SPPS中的功能化：(a) 扫描电子显微镜（SEM）比较了氨基甲基-1%交联凝胶型聚苯乙烯（AM-PS）树脂和6%交联大孔聚苯乙烯（SMPS）树脂。中心示意图说明了用间隔臂和Fmoc-RinkAmide连接器对AM-SMPS树脂的功能化，用于SPPS。(b) 通过汞侵入法测量的微孔率的高斯分布。AM-SMPS树脂的孔径分布。膨胀性
在包括绿色溶剂及其二元混合物在内的不同溶剂中评估了AM-SMPS树脂的膨胀性，以DMF作为参考。AM-SMPS树脂在所有测试的溶剂和混合物中都有良好的膨胀性。除了乙腈（MeCN）之外，膨胀值范围从4.5 mL g−1到7.0 mL g−1。在DMF中的膨胀值为6.2 mL g−1，而凝胶型AM-PS树脂的膨胀值约为4.5 mL g−1。除了DMF，在2-MeTHF和甲苯（Tol）等较少极性的溶剂中观察到了更高的膨胀性。这证实了溶剂在SMPS树脂颗粒内的良好扩散性，如图3所示（另见SI S1）。进一步在含有EtOAc的溶剂混合物中评估了AM-SMPS树脂的性能。在这三种混合物中，MeCN、三乙基磷酸酯（TEP）和Tol的表现都相当。选择这种比例是为了避免形成共沸物。这一点很重要，因为共沸混合物无法蒸馏。在这三种组合中，EtOAc:Tol的比例显示出更好的膨胀性能，因此被用于后续实验。图3
首先，使用标准SPPS协议将Fmoc-RinkAmide连接器连接到AM-SMPS树脂上。加入连接器后，载量达到了0.43 mmol g−1，非常接近理论载量0.47 mmol g−1（从名义载量0.62 mmol g−1）。为了建立一个可靠的合成策略，我们首先使用一个短的模型五肽H-YGGFL-NH2，评估了不同溶剂在Fmoc基SPPS中的性能。合成在室温下使用标准协议在Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂上进行（0.043 mmol规模），使用的溶剂包括DMF（作为参考）、MeCN、EtOAc、TEP、丙酮、2-MeTHF、DMSO、Tol和EtOAc–Tol（3:1）（方案1）。
用于在Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂上合成H-YGGFL-NH2的协议。溶剂：DMF、MeCN、EtOAc、TEP、丙酮、2-MeTHF、DMSO、Tol和EtOAc–Tol（3:1）。表1、图4和S2中的结果显示，SMPS树脂适用于SPPS。有趣的是，它在MeCN中的表现（表1中的#2）与在DMF中的表现非常相似（#1，参见SI S2）。此外，这证实了我们之前的工作，即MeCN与可膨胀树脂（如聚乙二醇-聚苯乙烯（PEG-PS）结合，是SPPS的高效溶剂系统。观察到的主要杂质是des-Leu肽，这是在SPPS中常见到的，以及带有Fmoc的保护肽。前者可能是由于RinkAmide-AMPS树脂中的Fmoc部分去除或第一个保护氨基酸（Fmoc-Leu-OH）的插入效率低下所致。在这种情况下，因为在插入Fmoc-Leu-OH之后进行了乙酰化步骤，des-Leu杂质很可能是由于Fmoc基团从RinkAmide部分部分去除所致。通过增加树脂的膨胀时间和/或延长Fmoc去除步骤可以缓解这个问题。如果排除这两种副产物（因为它们是可以避免的），在2-MeTHF（#5）、EtOAc（#7）和EtOAc–Tol（3:1）混合物（#9）中进行的合成也获得了优异的产率。单独使用Tol（#8）也得到了可接受的结果，而丙酮（#3）、TEP（#4）和DMSO（#6）则没有提供满意的结果。在丙酮的情况下，一个重要的杂质是亚胺终止的肽（见图4）。
在室温下使用不同溶剂合成H-YGGFL-NH2。梯度：5–60%的B在15分钟内进入A；流速：1 mL min−1；在220 nm处检测。表1
不同溶剂中H-YGGFL-NH2的HPLC分析
溶剂
H-YGGFL-NH2
Des F
Des Y
Des L
Des G
Fmoc-YGGFL-NH2
其他
A
B
C
D
E
F
G
A + D + F
1
DMF
95.4
0.4
0.6
0.9
0.8
—
1.9
96.3
2
MeCN
95.2
—
1.1
1.4
1.2
—
1.1
96.6
3
丙酮
78.1
0.4
0.1
1.4
1.9
—
18.1
79.5
4
TEP
25.9
—
—
38.8
—
35.3
64.7
5
2-MeTHF
78.3
0.3
—
7.0
2.1
10.9
1.4
96.2
6
DMSO
72.0
5.0
3.5
0.5
14.0
—
5.0
72.5
7
EtOAc
52.4
0.3
1.1
6.2
0.3
37.9
1.8
96.5
8
Tol
71.7
1.2
2.9
9.6
7.5
6.4
0.7
87.7
9
EtOAc–Tol (3:1)
60.4
—
0.4
4.0
0.7
33.5
1
97.9
在50°C下合成模型肽YGGFL的步骤
基于这些观察结果，除了丙酮（因为在较高温度下亚胺杂质可能会变得更明显）外，其他溶剂在相同的肽合成过程中进一步在50°C下进行了评估，以确定加热是否可以通过增强反应动力学、改善树脂膨胀和加速试剂进入聚合物基质来克服观察到的限制。尽管TEP在室温下的表现不佳，但由于它是一种绿色溶剂，并且在我们之前的工作中已经成功使用过，31,37 因此有必要评估其在热增强条件下的行为。在这些条件下，大多数选定的溶剂（DMF（#1）、MeCN（#2）、TEP（#4）和EtOAc（#6）以及EtOAc–Tol（3:1）混合物（#8）的HPLC纯度都超过了90%。此外，2-MeTHF（#4）和DMSO（#5）在升高温度下的表现有所提高，肽的纯度达到了84%。相比之下，Tol（#7）仍然效率低下，出乎意料地只提供了34%的纯度（见图5和表2）。
图5
在50°C不同溶剂中合成H-YGGFL-NH2的步骤。梯度：15分钟内从5% B逐渐变为60% A；流速：1 mL min−1；检测波长：220 nm。表2
不同溶剂中H-YGGFL-NH2的HPLC纯度以及50°C时各种杂质的相对百分比
溶剂
H-YGGFL-NH2
Des F
Des Y
Des L
Des G
Fmoc-YGGFL-NH2
其他
1
DMF
95.9
0.9
1.4
1.2
0.6
—
—
2
MeCN
99.1
—
—
—
—
—
0.9
3
TEP
95.7
—
—
1.3
0.6
—
2.4
4
2-MeTHF
83.6
4.4
1.8
0.4
4.5
1.7
3.6
5
DMSO
84.1
3.9
3.7
0.7
3.8
—
3.8
6
EtOAc
99.3
0.3
—
—
—
—
0.4
7
Tol
33.6
14.4
5.1
0.1
23.9
1.4
21.5
8
EtOAc–Tol (3:1)
92.6
—
—
0.7
0.3
5.0
1.4
在50°C下合成模型肽H-(YGGFL)2-NH2的步骤
由于在50°C下合成H-YGGFL-NH2的结果有所改进，随后在同一温度条件下进行了相应十肽H-YGGFLYGGFL-NH2（长度是五肽YGGFL的两倍）的合成。在这个阶段，使用DMF作为参考溶剂，并在MeCN、EtOAc和TEP以及EtOAc–MeCN、EtOAc–TEP和EtOAc–Tol（3:1）混合物中进行合成，以评估在较高温度下观察到的效率提升是否可以在更长的肽组装过程中保持（见图6、表3和图S3）。有趣的是，使用DMF（#1）得到的结果最差（也见SI S3中的LC-MS结果）。即使是TEP（#4），在室温下表现最差，但在这些条件下也提供了略好的结果。再次，MeCN（#2）表现最佳，其次是EtOAc（#3）。基于EtOAc的三种混合物（MeCN（#5）、TEP（#6）和Tol（#7）也提供了可接受的结果，特别是考虑到des-Leu是所有这些合成中的主要杂质。总的来说，这些结果证实了使用简单的溶剂如EtOAc、MeCN和Tol及其混合物，在使用适当的树脂时，能够实现高效的固相肽合成。
在50°C不同溶剂中合成H-(YGGFL)2-NH2的步骤。梯度：15分钟内从5% B逐渐变为60% A；流速：1 mL min−1；检测波长：220 nm。表3
不同溶剂中H-(YGGFL)2-NH2的HPLC纯度以及50°C时各种杂质的相对百分比
溶剂
H-(YGGFL)2-NH2
Des F
Des L
Des G
其他
1
DMF
77.0
4.0
0.8
5.2
13.0
2
MeCN
90.9
—
0.7
—
8.4
3
EtOAc
89.9
—
3.6
—
6.5
4
TEP
79.0
—
3.2
—
17.8
5
EtOAc–MeCN (3:1)
90.0
—
2.0
1.0
7.0
6
EtOAc–TEP (3:1)
84.7
—
3.6
2.6
9.1
在50°C合成afamelanotide类似物（13聚肽）的步骤
最后，在50°C下评估了这些溶剂系统在合成afamelanotide类似物（H-Ser-Tyr-Ser-Leu-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2）时的表现。在这个模型系统中，所有合成中观察到的两种主要杂质是des-Lys和des-Ser（见图7、表4和图S4）。使用DMF（#1）、MeCN（#2）和EtOAc（#3）的单溶剂系统获得了相当的结果，粗肽的纯度约为66-70%。相比之下，TEP（#4）再次表现最差，纯度低于40%。与十肽的合成类似，EtOAc与MeCN（#5）、TEP（#6）和Tol（#7）的三种二元混合物获得了最高的纯度，全部超过了75%。其中，EtOAc–Tol（3:1）混合物的结果最佳，粗肽的纯度达到了81%（见图7中的LC-MS结果，见图S4）。总体而言，虽然单溶剂系统仅产生了中等纯度，但使用混合溶剂系统则显著改善了结果，纯度范围在77-81%之间。EtOAc–Tol（3:1）混合物的优异表现可能是由于极性和疏水性之间的最佳平衡、增强的质量传递以及减少的聚合诱导的副反应。因此，这种溶剂混合物被确定为进一步优化的最有效系统。
在50°C下合成afamelanotide类似物的步骤。梯度：15分钟内从5% B逐渐变为60% A；流速：1 mL min−1；检测波长：220 nm。表4
不同溶剂中afamelanotide类似物的HPLC纯度以及50°C时各种杂质的相对百分比
溶剂
afamelanotide类似物
Des S
Des K
其他
1
DMF
79.1
13.3
1.1
6.5
2
MeCN
72.4
14.9
0.9
11.8
3
EtOAc
77.5
13.0
1.5
8.0
4
TEP
42.0
10.9
1.7
45.4
5
EtOAc–MeCN (3:1)
77.7
13.0
3.8
5.5
6
EtOAc–TEP (3:1)
78.4
12.0
1.6
8.0
7
EtOAc–Tol (3:1)
81.2
10.0
5.6
3.2
在afamelanotide类似物的合成中进行优化
在上一节中，已经证明可以使用SMPS树脂结合EtOAc与MeCN、TEP或Tol的二元溶剂混合物以相当好的产率合成afamelanotide类似物。在筛选的条件中，EtOAc–Tol（3:1）混合物获得了最高的粗肽纯度（81%）。基于这一结果，并考虑到EtOAc、Tol和DMSO在GSK溶剂选择指南中被分类为“黄色”（即存在一些问题），48 这个二元系统被选为进一步优化的对象。对粗肽的详细LC-MS分析显示了des-Ser和des-Leu缺失序列的存在，表明这些残基的偶联不完全和/或之前的氨基酸的Fmoc去除不足。为了解决这些问题，实施了两种互补的优化策略。首先，将Fmoc去除时间从15分钟增加到30分钟，因为在序列中鉴定Leu、Tyr、Pro和His残基是不完全脱保护可能会影响后续偶联效率的关键点。其次，通过在1小时后额外加入3当量的DIC，并再增加30分钟的偶联时间来加强偶联过程，以完成反应。这些修改显著减少了缺失序列的形成，表明延长的Fmoc去除和加强的偶联条件是提高afamelanotide类似物粗肽纯度的有效策略，在EtOAc–Tol二元溶剂系统中，纯度达到了91%（见图8中的LC-MS结果，见图S5）。
在优化后50°C合成afamelanotide类似物。梯度：15分钟内从5% B逐渐变为60% A；流速：1 mL min−1；检测波长：220 nm。蒸馏溶剂EtOAc–Tol（3:1）和过程质量强度（PMI）
在肽合成中，可持续性通常通过减少溶剂消耗或通过蒸馏实现溶剂回收来解决。然而，在API的工业生产中，溶剂蒸馏并不容易应用，因为来自偶联、洗涤和Fmoc去除步骤的收集废物流通常含有哌啶、过量的氨基酸和偶联试剂，这些都使得溶剂回收变得复杂。因此，在应用蒸馏之前必须仔细考虑几个参数，以确保蒸馏仍然具有成本效益。为了评估溶剂回收的可行性和影响，选择了afamelanotide类似物的合成作为代表性案例研究，并首先在不进行溶剂回收的情况下计算了其过程质量强度（PMI）。在这些条件下，获得了3206的PMI，与其他SPPS（在聚苯乙烯树脂的情况下使用DMF作为溶剂时PMI为2242）的结果一致。49 用于合成的溶剂体系是乙酸乙酯和Tol（3:1）的混合物。值得注意的是，这种溶剂组合据报道不会形成共沸物，50 使其适合蒸馏。在afamelanotide类似物合成后，用0.1 N HCl处理了总的废物，以去除过量的未反应哌啶。提取后，收集了总共160 mL的溶剂废液并进行了蒸馏。蒸馏后成功回收了116 mL的溶剂混合物。通过1H NMR进一步确认了回收的溶剂（见图9）。将这种溶剂回收纳入PMI计算（公式（2）后，PMI显著降低到了1137，相当于溶剂贡献减少了大约65%，清楚地表明溶剂回收对改善肽合成的可持续性轮廓有显著影响。
收集的蒸馏溶剂后的1H NMR。回收的溶剂可以被重新定义为相同的EtOAc∶Tol（3:1）比例，并在调整后可以再次用作进一步合成中的溶剂，使过程更加可持续。该方法也可以转移到自动肽合成器中，支持其稳健性和实际应用性。此外，回收的溶剂流还可以用于其他工业应用（例如，油漆和清漆），从而有助于减少废物和提高资源效率。
材料、试剂和方法
对于SPPS，使用了带有聚丙烯过滤器的长筒注射器，并从Chemetrix购买。使用优先方法由Sunresin（中国西安）制造了含有6%二乙烯基苯（0.62 mmol g−1）的大孔聚苯乙烯（SMPS）聚合物。用于合成的溶剂DMF、乙腈（MeCN）、乙酸乙酯（EtOAc）、丙酮、甲苯（Tol）、DMSO和2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）从Honeywell购买。另一种使用的溶剂triethyl phosphate（TEP）以及试剂N,N″-diisopropylcarbodiimide（DIC）和OxymaPure是由Luxembourg Bio Technologies（以色列Nes Ziona）慷慨提供的礼物。其余的试剂，如diisopropylethylamine（DIEA）、乙酸酐（Ac2O）、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）等溶剂来自不同的商业来源。哌啶（PIP）从Sigma-Aldrich购买。Fmoc-氨基酸（Fmoc-AA-OH）来自Iris Biotech（德国Marktredwitz）。额外的有机溶剂和HPLC级别的MeCN从Merck获得。Milli-Q水用于在配备Phenomenex Aeris™C18（3.6 μm，4.6 × 150 mm）柱的Shimadzu-LC-2050上进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析。分离以1.0 mL min−1的流速进行，检测波长为220 nm，数据使用LabSolutions软件处理。流动相由缓冲液A：0.1% TFA在水中的溶液；缓冲液B：0.1% TFA在MeCN中的溶液组成。
EtOAc–Tol (3:1)（溶液A）
准备了400 mL的溶液A。在500 mL的量筒中放置了300 mL的EtOAc，并用Tol补充至400 mL。同样地，也准备了EtOAc–MeCN (3:1)和EtOAc–TEP (3:1)。
20% PIP/DMF（溶液）B)
20%体积比的PIP溶液被制备出来。准备了50毫升的溶液A。将10毫升PIP放入50毫升的量筒中，并用DMF将体积补足至50毫升。同样地，还准备了其他溶液，如20% PIP/MeCN、20% PIP/EtOAc、20% PIP/TEP、20% PIP/Tol、20% PIP/DMSO、20% PIP/2-MeTHF、20% PIP/乙酮、20% PIP/EtOAc–MeCN（3:1）、20% PIP/EtOAc–TEP（3:1）和20% PIP/EtOAc–Tol（3:1）。AM-SMPS树脂的膨胀
将200毫克的SMPS树脂装入一个5毫升的聚丙烯烧结注射器中，在25°C下用溶剂（10体积）在摇床中膨胀30分钟。然后压缩树脂，并通过过滤去除溶剂。缓慢拉动活塞，使树脂达到其最大膨胀体积，并记录下来。从测量值中减去0.15毫升的空隙体积（注射器尖端和烧结部分）。膨胀程度使用以下公式计算：
将Fmoc-RinkAmide连接基团引入AM-SMPS树脂
首先，使用标准协议将Fmoc-RinkAmide连接基团引入AM-SMPS树脂中。称量Fmoc-RinkAmide-OH连接基团（3.34克，5.0当量）和OxymaPure（881毫克，5.0当量），并溶解在DMF（20毫升，10体积）中，然后加入DIC（966.0微升，5.0当量）。预活化1分钟后，将溶液转移到装有膨胀树脂的注射器反应容器中，并在室温下摇床中放置2小时。2小时后过滤树脂，并用DMF（10体积×3）清洗三次。为了封住未反应的位点，使用Ac2O（703.0微升，10.0当量）和DIEA（4.3毫升，20.0当量）在DMF（10体积）中进行了乙酰化处理，然后转移到注射器反应容器中，并在室温下摇床中放置30分钟。最后，过滤树脂，并用DMF（10体积×3）+ DCM（10体积×3）清洗，完全干燥后得到2.64克的目标树脂。产率=99.6%。装载量测定
Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂的装载量（取代率）通过光谱法测定。将10毫克的Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂与20% PIP/DMF（2.5毫升）在容量瓶中处理。该混合物在室温下摇床中放置30分钟。接着向容量瓶中加入MeOH，并将体积补足至50毫升。同样地，在另一个容量瓶中制备空白溶液。使用石英比色皿在光谱仪中测量该溶液在300纳米处的吸光度。树脂装载量使用以下公式计算：
L = (abs × vol)/ε × l × m
其中L = 装载量，abs = 300纳米处的吸光度，vol = 最终体积，ε = 释放的二苯并呋喃-哌啶加合物的消光系数（6.350 L mmol−1 cm−1），l = 光路长度，m = 树脂重量。肽的合成
模型五肽Leu-enkephalin（YGGFL）、十肽（YGGFLYGGFL）和afamelanotide类似物（13个氨基酸的肽）在Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂上使用标准的基于Fmoc的SPPS方法，在各种单组分和二元溶剂系统中合成。YGGFL的合成在25°C和50°C下进行，而十肽和afamelanotide类似物仅在50°C下合成。合成的一般步骤如下。一般步骤
将100毫克的Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂在测试溶剂中膨胀，然后用相应的溶剂中的20% PIP（10体积）去除Fmoc基团。然后在真空下过滤树脂，并用相同的溶剂（10体积×3）清洗。首先使用Fmoc-AA-OH（3.0当量）进行氨基酸偶联，用DIC（3.0当量）和OxymaPure（3.0当量）活化，然后在DMF（1毫升，10体积）中进行。预活化1分钟后，将偶联溶液加入Fmoc-RinkAmide-AM-SMPS树脂中，并在摇床中 shaken 1小时。然后过滤树脂，并用DMF（10体积×3）清洗。首次偶联后，使用Ac2O（41.0微升，10.0当量）和DIEA（150.0微升，20.0当量）在DMF（10体积）中进行30分钟的乙酰化处理，因为RinkAmide部分的苯甲酰氨基亲核性较差。最后，过滤树脂，并用DMF（10体积×3）+ DCM（10体积×3）清洗。重复Fmoc基团的去除和随后的氨基酸偶联，直到形成最终肽链。全局脱保护
肽链组装完成后，使用TFA–H2O–TIS（95:2.5:2.5）（10体积）在室温下切割1小时以从树脂中释放肽。通过加入冷甲基叔丁基醚（MTBE）（10体积）使粗肽沉淀，然后通过离心收集。舍弃上清液，并重复沉淀步骤两次。将残余物蒸发至干燥，然后溶解在水和乙腈中，用于HPLC分析，检测波长为220纳米。EtOAc–Tol（3:1）的蒸馏
进行蒸馏实验以评估从afamelanotide类似物合成过程中产生的EtOAc、Tol或混合物在EtOAc–Tol（3:1）溶剂系统中回收的可行性。蒸馏装置包括一个用于控制溶液加热的油浴加热器、一个装有温度探头的Vigreux分馏柱、一个冷凝器和一个收集蒸馏物的接收器。结论
本文的工作表明，提高SPPS的可持续性需要采取多因素的方法。传统上，我们小组和其他研究团队通常专注于修改单个参数，最常见的是溶剂，同时保持所有其他变量（树脂、偶联试剂和协议）不变。因此，除了NBP之外，没有替代溶剂能够完全替代DMF，当使用凝胶型聚苯乙烯树脂（1-2%二乙烯基苯）作为固体支撑时。这一限制推动了二元溶剂混合物的研究，最广泛采用的系统是将DMSO或NBP与其他溶剂组合使用，如EtOAc（最常见）、tBuOAc、TEP或IPA。然而，DMSO和NBP都被归类为“黄色”溶剂，具有非常高的沸点（DMSO为189°C，NBP为240°C），这阻碍了通过蒸馏的有效回收，而DMF的沸点为153°C。在这种情况下，研究由更温和成分组成的溶剂系统，并且沸点适合溶剂回收的方法变得特别有吸引力。在这里，我们证明了使用可膨胀的大孔聚苯乙烯（SMPS）树脂可以在MeCN、EtOAc和2-MeTHF等替代溶剂中高效地进行SPPS反应，以及它们的混合物，而不需要高沸点的极性非质子溶剂如DMSO或NBP。作为第一个例子，我们提出了EtOAc–Tol二元混合物；尽管我们承认Tol的环保性不如DMF，因此不是一个理想的绿色溶剂，但这个系统证明了概念的可行性。这项工作补充了我们之前的研究，其中使用刚性树脂显著减少了溶剂的使用量。我们实验室正在进行的工作专注于结合这两种方法，以最小化溶剂使用量，同时实现溶剂回收，从而进一步提高SPPS的可持续性。作者贡献
M. K.、S. B.和A. K.进行了膨胀实验和肽的合成；M. K.准备了手稿的初稿；Sunresin的研究人员设计并制备了SMPS树脂；A. S.负责PMI和NMR分析。B. G. T.和F. A.监督了UKZN的研究工作并准备了手稿的最终版本；A. S.和A. K.参与了初稿的准备工作；最终版本得到了所有作者的同意。利益冲突
Sunresin的研究人员声明Sunresin出售用于SPPS的树脂。其余作者声明没有利益冲突。数据可用性
支持本文的数据已包含在补充信息（SI）中。补充信息可以获取。HPLC和质谱数据在补充信息中提供。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6gc01716a。致谢
我们感谢Yoav Luxembourg对这项工作的支持。参考文献
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