活性氧（ROS）是肿瘤微环境（TME）中氧化应激的关键生物标志物，但其无创、实时可视化仍具挑战。本研究开发了一种包裹全氟戊烷（PFP）气体的生物素化聚乙二醇修饰胆红素纳米气泡（bt-PEG-BR@PFP），作为ROS响应的双模态超声（US）与磁共振成像（MRI）造影剂。当暴露于ROS时，胆红素外壳发生氧化降解，引发纳米气泡融合，同时在US与T2*-加权MRI中实现信号放大。体外实验中，在A549癌细胞中验证了生物素介导的细胞摄取及ROS诱导的融合效应。体内实验中，将bt-PEG-BR@PFP瘤内注射至双肿瘤异种移植模型后，ROS高表达的A549肿瘤US信号强度较ROS低表达的DU145肿瘤提升超过3.7倍，且该效应可被ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸阻断。全身给药后，纳米气泡通过生物素介导的靶向特异性富集于A549肿瘤，US信号强度约为DU145肿瘤的50倍；而临床造影剂SonoVue未表现出此类肿瘤选择性与ROS响应信号增强。MRI研究显示，仅bt-PEG-BR@PFP处理的A549肿瘤出现随时间依赖性的信号降低，与ROS介导的纳米气泡融合一致。结果表明，bt-PEG-BR@PFP是一种具有临床转化潜力的无创双模态成像平台，可用于肿瘤氧化应激的可视化，并在多种ROS相关疾病中具有应用前景。
本研究发表于《Advanced Science》，聚焦于肿瘤氧化应激的无创可视化这一肿瘤诊疗领域的关键难点。活性氧（ROS）在肿瘤微环境（TME）中参与免疫逃逸与治疗抵抗过程，其动态监测对评估肿瘤侵袭性及疗效至关重要。然而现有ROS响应荧光探针因组织穿透力弱、深层肿瘤分辨率不足，临床转化受限；临床常用超声造影剂SonoVue以六氟化硫（SF6）为内核，虽提升了超声成像灵敏度，但SF6的温室效应及缺乏病理参数响应能力限制了其进一步发展，同时兼具超声（US）与磁共振成像（MRI）双模态响应的ROS探针尚未见报道。针对上述问题，研究人员构建了生物素化聚乙二醇修饰胆红素包裹全氟戊烷（PFP）气体的纳米气泡（bt-PEG-BR@PFP），利用ROS触发的外壳脱落与气泡融合机制实现双模态信号放大，为肿瘤氧化应激的无创实时监测提供了新工具。
研究采用的关键技术方法包括：制备双肿瘤异种移植模型，分别在BALB/c裸鼠双侧 flank 接种ROS高表达的A549人肺癌细胞与ROS低表达的DU145人前列腺癌细胞；通过瘤内与全身（眶后静脉）两种给药途径开展活体成像；结合超声与3T MRI系统采集双模态影像数据；利用二氢乙锭（DHE）染色验证肿瘤ROS水平；采用近红外荧光染料cypate标记纳米气泡以追踪体内分布与药代动力学特征。
研究结果如下：
2.1 bt-PEG-BR@PFP纳米气泡的合成、表征及ROS响应性
研究人员通过薄膜水化联合超声法制备平均直径约512.6 nm的bt-PEG-BR@PFP纳米气泡，其流体力学直径在24小时内保持稳定。以次氯酸钠（NaOCl）模拟ROS暴露后，纳米气泡直径显著增大至约1600 nm，紫外-可见吸收光谱由胆红素的黄色特征峰转变为胆绿素的绿色特征，证实ROS介导的外壳氧化与气泡融合；而SonoVue在相同处理下尺寸无变化。细胞实验显示，A549细胞通过生物素介导的内吞作用大量摄取bt-PEG-BR@PFP并形成细胞内微泡，游离生物素预处理可阻断该过程。体外超声幻影成像中，纳米气泡与A549条件培养基共孵育后10分钟即出现强信号，而DU145条件培养基组无显著增强，且对NaOCl与过氧化氢（H2O2）均呈浓度与时间依赖性信号响应，回声持续时间显著长于SonoVue。
2.2 瘤内注射bt-PEG-BR@PFP纳米气泡的肿瘤ROS超声成像
在双侧荷瘤模型中，瘤内注射bt-PEG-BR@PFP后，ROS高表达的A549肿瘤超声亮度在15分钟达峰值，较基线升高约373%，而ROS低表达的DU145肿瘤仅轻微增强；SonoVue在两组中信号增幅相近且无ROS依赖性。经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸预处理后，A549肿瘤的信号增强被显著抑制，进一步证实信号变化由肿瘤内ROS驱动。
2.3 全身给药bt-PEG-BR@PFP纳米气泡的肿瘤ROS超声成像
全身给药后，bt-PEG-BR@PFP在A549肿瘤部位的超声信号随时间持续升高，30分钟时信号增幅为无生物素靶向的PEG-BR@PFP组的3.3倍；在双侧荷瘤模型中，A549肿瘤信号约为DU145肿瘤的50倍，而SonoVue无组间差异。结果表明生物素靶向与ROS触发的融合共同贡献了成像特异性。
2.4 全身给药bt-PEG-BR@PFP纳米气泡的肿瘤ROS磁共振成像
体外弛豫率测定显示，ROS触发融合后纳米气泡的T2弛豫率提升约3倍，磁化率由0.60 ppm/M升至1.04 ppm/M。T2-加权MRI幻影成像中，随NaOCl浓度升高，图像暗点数量与强度同步增加。活体MRI显示，全身给药bt-PEG-BR@PFP后，A549肿瘤区域信号随时间进行性降低，而SonoVue组无显著变化，证实其双模态ROS响应能力。
2.5 bt-PEG-BR@PFP纳米气泡的生物分布、药代动力学与毒性
近红外荧光示踪显示，纳米气泡给药后6小时在肿瘤部位仍有明显富集，主要经肝胆与肾脏清除。药代动力学符合二室模型，分布半衰期t1/2α为0.446小时，消除半衰期t1/2β为5.29小时，足以支持肿瘤成像。正常ICR小鼠给药后7天内体重、血常规、肝肾功能及主要器官组织病理学均无异常，未见明显体内毒性。
讨论与结论部分指出，bt-PEG-BR@PFP通过ROS介导的胆红素外壳氧化脱落触发PFP内核融合，实现了超声与T2*-加权MRI的双重信号放大。相较于SonoVue，其兼具生物素靶向性与ROS响应性，可在全身给药后特异性识别并可视化高ROS肿瘤微环境。尽管超声普及度高但分辨率有限，MRI分辨率优异但成本较高、扫描时间较长，该平台仍需根据具体临床场景优化应用。总体而言，该研究为肿瘤氧化应激的无创实时监测提供了一种安全、有效的双模态成像策略，在肿瘤学、炎症疾病及氧化还原生物学领域具有广泛转化潜力。
