骨骼再生，尤其是在关键尺寸的缺损中，仍然是一个重大的临床挑战。羟基磷灰石（HA）由于其与骨矿物质的相似性而被广泛使用，但其生物活性通常需要改进。加入治疗性金属离子显示出了一定的前景，但铜（Cu）和锶（Sr）的联合效应及其机制差异仍需进一步研究。Cu和Sr通过不同的信号通路影响干细胞：Cu增强了血管生成并调节了分化，而Sr促进了骨形成和骨重塑。重要的是，这些差异不仅限于对干细胞的调控；Cu和Sr在骨形成和血管生成中激活了不同的机制。当它们联合使用时，这种双重作用产生了真正的协同效应，独立地增强了骨生成和血管生成的结果，超出了任何一种离子单独所能达到的效果。为了利用这一点，我们开发了一种由聚 vinyl alcohol（PVA）和海藻酸钠（SA）组成的可注射双重网络水凝胶，并加入通过水热法合成的Cu/Sr共掺杂的HA。通过改变合成温度（80、120、160 °C），我们发现了HA结晶度对生物活性的依赖性，并确定120 °C为结合机械稳定性和生物性能的最佳温度。细胞毒性测定确立了Cu的安全阈值，并确定了Cu和Sr的单离子最佳浓度。值得注意的是，在这些最佳浓度下共掺杂得到的复合材料具有优异的可注射性、体外和体内的生物相容性，最重要的是，通过互补机制协同促进了骨形成和血管生成。这种双离子策略为骨骼修复中的骨骼和血管再生提供了新的途径。
1. 引言
骨骼再生在再生医学和骨科中仍然是一个关键挑战，1-3特别是对于超过身体固有愈合能力的临界尺寸缺损（1-3厘米）4,5。这些由创伤、肿瘤切除或退行性疾病引起的缺损通常需要移植来桥接间隙并刺激修复。自体移植物（患者自身的骨骼）因其骨形成能力和相容性而被认为是黄金标准，但其使用受到供体部位并发症和有限供应的限制。异体移植（尸体骨骼）避免了供体部位的问题，但仍有免疫排斥和疾病传播的风险，且机械性能不稳定。异种移植（动物来源的骨骼）面临着类似的免疫屏障和更高的感染风险。9虽然这些基于移植的方法主导了临床实践，但它们的局限性——包括二次手术、生物变异性和感染风险——推动了对具有可调性能和减少并发症的合成替代品的需求。9-12
合成骨移植材料，如羟基磷灰石（HA），通过提供可调的机械性能和消除供体部位的并发症，解决了自体移植的局限性。13-15虽然HA与天然骨矿物质的化学相似性是其骨传导性的基础，但其生物性能取决于其结晶度——这一参数可以通过水热合成条件来控制。16在较高温度（>200 °C）下合成的高结晶度HA具有适合承重应用的强大机械强度，但其降解速率较慢，限制了离子交换和新骨的形成。17相反，在较低温度（80-120 °C）下合成的HA结晶度较低，更有效地模仿了新生骨矿物质，增强了生物吸收和成骨细胞的粘附。然而，在较低合成温度下产生的过多非晶态内容物会损害结构完整性，导致移植物过早溶解。18水热合成通过调节反应温度可以精确控制结晶度。19 Feng等人证明，将温度从80 °C提高到200 °C可以使HA的晶体生长从c轴主导转变为a轴主导，改变表面形貌和蛋白质吸附动态。20 Balasundaram等人显示，无定形磷酸钙比纳米晶体或烧结HA支持更多的成骨细胞粘附，尽管它们之间的极端温度差异（80 °C vs. 1100 °C）使直接比较结晶度变得复杂。17新兴的多温度水热协议提出了梯度结晶度支架，这可能实现了空间控制的降解和骨化。鉴于当前骨组织工程的现状，人们正逐渐从昂贵且可能存在风险的重组生长因子（如BMP-2和VEGF）转向更稳定的“无药物”离子基方法。21在这种背景下，钙和磷等非金属元素对于形成结构矿物基质至关重要，而金属微量元素（例如Cu、Sr、Mg、Zn）作为强大的生物指示剂，可以积极调节血管生成、骨形成和骨重塑。22 HA表现出独特的离子交换能力，能够在保持其结晶结构的同时，用治疗性二价金属（如铜（Cu）和锶（Sr）替代表面钙离子（Ca）。23这一特性使得HA生物材料的功能化能够在骨骼再生过程中增强特定的生物反应。Cu显示了多功能作用，作为参与电子转移、氧气运输和金属稳态的酶蛋白的辅因子。24将其掺入骨移植材料中可以通过激活血管内皮生长因子来促进血管生成，改善植入部位的营养输送。25此外，Cu还表现出抗菌效果并刺激胶原蛋白沉积，尽管最佳浓度仍然很重要。26研究表明剂量效应存在，其中低浓度Cu（≤1.0 wt%）增强了成骨细胞活性和血管化，而高浓度（≥2.0 wt%）则在啮齿动物模型中抑制了碱性磷酸酶活性、胶原蛋白合成和异位骨形成。27这种双相反应强调了在材料合成过程中精确控制掺杂剂的必要性。28相比之下，Sr表现出对骨重塑的双重调节作用，29包括通过钙感应受体（CaSR）激活来刺激成骨细胞分化，以及抑制破骨细胞介导的吸收。30其离子半径和与钙的相似性使其能够整合到HA的原子结构中，并在材料降解过程中释放。31临床应用表明，自2004年以来，锶拉贝拉特在骨质疏松症治疗中显示出疗效，验证了其合成代谢和抗分解代谢的作用。31在骨科植入物上涂层的锶掺杂HA通过上调RUNX2和骨钙素等骨形成标志物增强了骨整合。30新兴研究探索了多离子掺杂的协同效应，尽管现有证据仍然有限。虽然Wu等人25展示了Cu–Si共掺杂增强了骨形成，但仍需要系统地研究Cu和Sr的具体组合。与主要支持早期基质合成的Si不同，Sr以其独特的双重作用药理学特性而脱颖而出。32,33 Cu增强了血管化和骨形成分化，而Sr促进了骨形成和矿物质密度。然而，关于Cu和Sr在HA中的联合效应的研究，尤其是在水凝胶系统中，仍然有限。仔细控制金属离子的剂量至关重要，因为过量的金属离子会抑制骨形成并引起炎症、氧化应激或全身毒性。34目前还没有确定的Cu和Sr的毒性阈值，HA结晶度对共掺杂系统中生物相容性和细胞附着的影响也尚未充分研究。解决这些空白有助于优化骨移植材料的机械和生物性能。为此，本文开发了一种结合了聚 vinyl alcohol（PVA）和海藻酸钠（SA）与Cu和Sr掺杂HA的双网络水凝胶。PVA通过其羟基团提供了出色的生物相容性和机械强度。35 4-羧基苯硼酸（CPBA）作为生物相容性交联剂，与PVA形成共价硼酸酯键。36 SA是一种天然多糖，通过形成钙离子的离子网络进一步增强了水凝胶的稳定性和细胞附着。37水热合成的Cu和Sr共掺杂HA通过增强其机械强度和提供生物活性离子的控制释放进一步强化了水凝胶。本研究介绍了PVA、SA、Cu/Sr掺杂HA的复合材料，并评估了水热合成条件如何影响HA的结晶度，进而影响复合材料的机械和生物性能。此外，该研究还探讨了复合材料中Cu和Sr的细胞毒性阈值和分化特性。最后，它还系统地研究了不同浓度的Cu和Sr掺杂对HA骨形成和血管生成潜力的影响。
2. 材料与方法
2.1 材料
硝酸钙（CaNO3，分子量：236.15，CAS：13477-34-4）、硝酸铜（CuNO3，分子量：241.60，CAS：10031-43-3）、硝酸锶（SrNO3，分子量：211.63，CAS：10042-76-9）、磷酸氢铵（分子量：115.03，CAS：7722-76-1）、氢氧化铵（最大33% NH3）、海藻酸钠（SA，CAS：9005-38-3）、聚 vinyl alcohol（PVA，分子量：85,000-124,000，CAS：9002-89-5）和氯化钙（CaCl2，分子量：110.98，CAS：10043-52-4）均从德国Sigma Aldrich购买。4-羧基苯硼酸（CPBA，CAS：14047-29-1）从美国Thermo-Fisher Scientific Chemicals购买。Advanced DMEM（Thermo-Fisher Scientific，美国）、内皮细胞生长培养基-2 BulletKit（EGM-2，CC-3162，Lonza，瑞士）、RPMI 1640培养基（Thermo-Fisher Scientific，美国）、青霉素-streptomycin抗生素（Pen-Strep，Thermo-Fisher Scientific，美国）、L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物（l-抗坏血酸，A8960，Sigma Aldrich，德国）、地塞米松（DXMS，D8893，Sigma Aldrich，德国）、β-甘油磷酸二钠盐水合物（BGP，G9422，Sigma Aldrich，德国）和胎牛血清（FBS，Invitrogen，英国）用于体外细胞培养。Resazurin钠盐（分子量：251.17，CAS：62758-13-8，Sigma Aldrich，德国）、佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA，P8139，Sigma Aldrich，德国）、Pico Green试剂（P7589，Thermo-Fisher Scientific，美国）和活/死细胞检测试剂盒（Thermo-Fisher Scientific，美国）用于细胞活力测试。Matrigel（356234，Corning，美国）用于管状结构形成 assay。碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（CAS：9001-78-9）、阿尔扎林-Red S（分子量：342.26，CAS：130-22-3）和十六烷基吡啶氯化物（CPC，分子量：358.00，CAS：6004-24-6）从德国Sigma Aldrich购买，用于骨形成评估。Trizol（Thermo-Fisher Scientific，美国）、iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，美国）和iTag Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，美国）用于RNA分离、cDNA合成和qRT-PCR检测。脂多糖（LPS，00-4976-03，ThermoFisher Scientific，美国）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α，DY210，RδD系统，美国）ELISA试剂盒用于基本的全血 assay。
2.2 方法
2.2.1 HA和金属掺杂HA颗粒的合成
使用水热合成方法合成了不同结晶度的HA。38简而言之，将等体积的1 M硝酸钙以1.5 ml min−1的速度缓慢滴入0.6 M磷酸氢铵溶液中（[Ca]/[P]为1.67），然后使用25%氢氧化铵调节pH值至10，并在室温下磁力搅拌两小时。然后将所得悬浮液转移到带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，溶液体积为高压釜容量的70%。进行了多次实验，将高压釜加热至80 °C、120 °C或160 °C，持续20小时。收集沉淀物并用乙醇离心均匀化，随后再次用乙醇离心分离沉淀物（2000 rpm），每个沉淀物重复此过程三次。之后用Milli Q水重复该程序。洗涤后，用超声波将沉淀物均匀分散在Milli Q水中，然后进行冻干。冻干后，HA粉末在密封塑料管中室温下保存，直至分析和进一步测试。HA的形成基于以下反应：
10Ca(NO3)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH → Ca10(PO4)6(OH)2 + 6H2O + 20NH4NO3
对于金属（M）掺杂的HA，用不同摩尔比的Cu（0.5%、1%、3%、5%）和Sr（2%、4%、8%、12%）替换Ca。这些材料将被标记为M-HA。[Ca + M]/[P]的摩尔比保持在1.67。双金属离子Cu/Sr-HA的合成过程与上述方法相同，只是在HA合成过程中添加了Cu和Sr（0.5 mol% Cu/4 mol% Sr或1 mol% Cu/4 mol% Sr）。水热合成方法和粉末获取与上述方法类似。
2.2.2 HA-PVA/SA可注射复合材料的合成
溶液A是通过将PVA在80 °C下的Milli Q水中搅拌3小时直至溶液变得均匀透明来制备的。对于溶液B，将6wt%的SA在室温下搅拌2小时溶解在Milli Q水中。然后准备不同浓度的CPBA溶液在10wt% NaOH中，并使用1 M HCl（溶液C）调节溶液的pH值（7.4或8.4）。为了制备复合材料，首先在30%wt的HA或M-HA颗粒存在下混合溶液A和B；之后，加入溶液C以交联PVA网络。最后，用1.4 M CaCl2溶液冲洗形成的凝胶以进行SA网络的离子交联，形成双重网络。最终使用6 mm的活检冲头（D = 6 mm，H = 3 mm）制备圆柱形样品。为了研究干态下的复合材料，将样品冻干并在室温下保存。
2.2.3 HA-PVA/SA复合材料的表征
通过扫描电子显微镜和能量分散X射线光谱（SEM，Zeiss EVO 15-EDX，Bruker Xflash 6/30双探测器）检查合成的HA颗粒的形态。相组成通过X射线光谱（XRD，Bruker D8 Advance，Cu Kα，λ = 0.15406 nm）进行分析，采用0.02°的步长。晶粒大小使用Scherrer（Ds）公式计算：
β表示半高宽（FWHM）；选择（002）平面来计算所有合成HA样品的Ds。
使用Thermo Scientific Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），配备Pike GladiATR衰减全反射（ATR）单元和金刚石窗口，在400至4000 cm−1范围内记录数据，以研究分子相互作用。使用WITec alpha 300 R共聚焦拉曼显微镜，配备532 nm激光器和每毫米600条栅线的光栅，获取HA颗粒的光谱，以研究不同掺杂物对HA结构的影响。每个光谱采集2秒，共10次，以获得信噪比良好的光谱。根据拉曼光谱结果，系统分析了特征v1磷酸盐带（957 cm−1）与OH/水带（3572 cm−1）的面积比，以及3572 cm−1带的FWHM，针对HA、1% Cu-HA和5% Cu-HA颗粒，以研究离子掺入HA后的结构变化。
2.2.4
体外实验
2.2.4.1
人类骨髓间充质干细胞（hMSCs）的获取与培养
在机构医学伦理委员会（METC 08-001 K和METC 07-125 C协议）的批准下，从荷兰乌得勒支大学医学中心接受骨科手术的患者处获取健康的骨髓样本。人类材料的获取遵循赫尔辛基宣言，得到当地医学伦理委员会（乌得勒支大学医学中心（UMCU）的批准，并获得了参与者的书面同意。通过Ficoll–Paque离心法获得单核细胞组分。随后的培养在添加了100单位/mL Pen-Strep和10% FBS的先进DMEM培养基中进行，直到细胞完全附着在培养瓶底部并增殖到70–80%的汇合度。然后将附着的原代细胞传代到相应的代数。第4或第5代细胞用于成骨分化实验，而第5或第6代细胞用于细胞毒性和细胞粘附性测定。这些hMSCs在加湿的培养箱中维持（37 °C，5% CO2，MCO-170AICUV-PE，Panasonic）。培养期间每周补充两次培养基。
2.2.4.2
人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养与扩增
HUVECs（Lonza，瑞士）在PBS-gel涂层的培养瓶中培养。为了预涂层t175培养瓶（Greiner Bio-One，德国），将10 ml PBS-gel（1%明胶）在培养箱条件下孵育5–6分钟。然后，HUVECs在EGM-2培养基中扩增，并在第6至第8代时使用。
2.2.4.3
THP-1细胞系的培养与分化
THP-1人单核白血病细胞（R&D Systems，USA）在添加了10%（v/v）FBS和1%（v/v）Pen-Strep的RPMI-1640培养基中维持。为了使THP-1分化为M0巨噬细胞，将5 × 10^5个细胞/mL在100 nM PMA培养基中孵育24小时，直到巨噬细胞附着在培养瓶底部。
2.2.4.4
体外实验样品的制备
从复合材料中收集上清液用于体外实验。简要来说，将复合材料浸泡在六孔板中的先进DMEM中，并在37 °C和5% CO2的条件下孵育，质量与体积的比例为1g/10 mL（基于ISO 10993-13）。然后在孵育1天、3天和7天后收集上清液并更新。在孵育0天、2天和6天时进行体外实验，使用孵育1天、3天和7天后的上清液。为了制备用于成骨分化实验的上清液，在复合材料孵育期间用成骨诱导培养基替换先进DMEM。第7天后，继续使用常规的成骨诱导培养基进行更换。为了制备用于血管生成实验的上清液，在复合材料孵育和细胞培养期间替换EGM-2培养基。
2.2.4.5
细胞毒性
进行Alamar蓝实验以研究复合材料的细胞代谢活性。简要来说，将5.54毫克resazurin盐溶解在50毫升PBS中。使用0.22 µm过滤器过滤混合溶液，然后在先进DMEM中稀释10倍。在96孔板的每个孔中接种5 × 10^3个hMSCs，并用复合材料的 上清液培养1天和7天，然后在细胞培养箱中与200 µL稀释的resazurin盐溶液一起孵育2小时。之后，将每组的100 µL上清液转移到新的96孔板中，用于微孔 plate reader（激发：560 nm，发射：590 nm，BMG LABTECH，德国）。所有实验组的数据都根据阳性对照（在常规培养基中孵育的细胞）进行了标准化，根据ISO 10993-5:2009使用70%的代谢活性的阈值来确定细胞毒性。对裂解的细胞进行Pico Green实验以量化每个孔中的DNA（dsDNA）含量。还使用在不同温度（80 °C、120 °C和160 °C）下合成的HA复合材料评估了HA结晶度对细胞粘附性的影响。简要来说，当复合材料（3 mm × 3 mm）放置在96孔悬浮板中时，将hMSCs播种在复合材料表面1天；然后按照上述方法进行Alamar蓝和Pico Green实验。通过荧光染色活/死细胞试剂盒（Calcein AM，绿色）视觉分析孵育1天和7天后的细胞存活情况。活细胞用Calcein AM染色，死细胞用ethidium homodimer-1（红色）染色。成像使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica SP8X，德国）。从含有（0.5%、1%、3%、5%）Cu和（2%、4%、8%、12%）Sr-HA颗粒的复合材料中收集上清液，以研究不同浓度金属离子的生物相容性。进行Alamar蓝、Pico Green实验和活-死细胞染色，以评估第1天和第7天的初始细胞存活率和增殖情况。
2.2.4.6
HUVECs迁移和管状形成实验
对于迁移实验，将HUVECs以5 × 10^5个细胞的密度播种在12孔板中，并孵育24小时直到细胞过度汇合。随后，用无菌P200移液管尖端在每个孔上制造划痕，用PBS清洗后去除未附着的HUVECs。然后将附着的HUVECs与复合材料的 上清液共培养0小时和24小时，并使用倒置显微镜（OLYMPUS，日本）成像。使用ImageJ软件将封闭区域与初始伤口面积的比例量化为细胞迁移率。对于管状形成实验，在预冷却的96孔板中放置30 µL解冻的Matrigel，并在37 °C下放置1小时以形成凝胶。然后将HUVECs以每孔2 × 10^4个细胞的密度播种在Matrigel上。它们在37 °C下与释放的上清液一起孵育6小时。使用光学显微镜（DMI1，Leica，德国）观察管状形成，并使用ImageJ软件中的血管生成分析插件自动量化节点数量、连接点数量、分支数量和分支长度。
2.2.4.7
ALP和茜素红实验
对于ALP实验，将5 × 10^3个hMSCs播种在96孔板中孵育24小时，然后添加释放的上清液以更新培养基。在7天、10天和14天后收集细胞并进行表征。细胞用0.2% Triton X-100渗透30分钟，然后在室温下按照ALP试剂盒说明进行ALP实验。为了研究细胞外基质的矿化，将5 × 10^4个hMSCs播种在48孔板中，并与释放的上清液和常规的成骨培养基一起孵育。在第21天，将细胞在100%乙醇中固定15分钟，然后用0.2% Alizarin Red S（pH 4.2）染色30分钟。使用体视显微镜（SZ61，OLYMPUS，日本）成像孔后，将附着的茜素红染料溶解在10% CPC和10 mM Na2H2PO4（pH 7.2）中。根据附着染料的浓度量化Ca离子的浓度。
2.2.4.8
RNA提取和qRT-PCR分析
通过qRT-PCR确定成骨（RUNX2/ALP/Col1/OCN）和血管生成（CD31/VEGF）标志物的mRNA表达。使用GAPDH和YWHAZ作为内参基因。引物的序列显示在表1中。14天后，使用细胞刮刀（541070，Greiner Bio-One，德国）收集细胞，并使用Trizol方法提取细胞的总RNA。提取的1 µg RNA通过iScript cDNA合成试剂盒反向转录为20 µL cDNA，然后将cDNA稀释到250 µL。下一个扩增反应系统的总体积为15 µL，包括5 µL cDNA、2.5 µL稀释的引物和7.5 µL iTaq Universal SYBR Green Supermix。退火在95 °C下进行15秒，延伸在60 °C下进行30秒，共40个循环；对于YWHAZ基因，将退火/延伸温度设置为65 °C。目标mRNA的表达通过2^-ΔΔCt方法量化；对照组进行了标准化，然后与其他组进行对比。表1显示了qRT-PCR实验中使用的引物序列。
2.2.5
基本全血实验
通过UMC Utrecht Mini Donor Dienst获得两名健康捐赠者的血液，并获得了当地医学伦理委员会的书面知情同意和授权。乌得勒支大学医学中心的医学伦理委员会（METC协议07-125 C；2010年3月1日）批准了这项实验。将10毫升血液在RPMI培养基中稀释5倍，然后在37 °C和5% CO2条件下与复合材料在48孔板中孵育24小时。使用含有1 ng/mL LPS和25 ng/mL PMA的稀释血液作为阳性对照。最终，将每个孔的血液离心（500 g，5分钟）以收集血清，用于ELISA kit测定TNF-α。
2.2.6
统计分析
所有定量测量考虑了三次技术重复。所有数据使用GraphPad Prism 8、ImageJ和Origin 2021进行绘图和分析。所有图表中的值都以平均值±标准差（SD）报告。统计分析使用了单因素和双因素ANOVA（用于分组比较），并且使用Bonferroni统计假设检验校正了多重比较测试。所有结果根据统计显著性差异进行分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
3. 结果
3.1
表征
在80 °C合成条件下，HA颗粒相对较小，形态不规则，有可见的聚集现象。在160 °C时，SEM图像显示颗粒大小显著增加，形态更加致密和聚集，表明较高的合成温度导致HA颗粒聚集增加（图1A）。对在不同温度（未加热、80 °C、120 °C和160 °C）合成的HA进行XRD分析，显示出结晶度和峰定义的显著变化（图1B）。标准HA显示出尖锐且定义明确的峰，这是高度结晶材料的特征。在特定的2θ值如25°、31.8°、32°和32.9°处的峰对应于结晶HA的（002）、（211）、（112）和（300）平面（数据库：96-230-0274,40,41）。在未加热的组中，在室温下合成的所有衍射峰都显示出显著的宽化。Kis等人的最新晶体学研究表明，天然骨矿物质以单斜钙磷酸盐介晶的形式存在。很可能我们不那么结晶的、未加热的沉淀物最初形成了一种类似单斜的前体相。随后进行的水热处理（80–160 °C）提供了必要的热动力学驱动力，促进连续的晶体生长和结构成熟。在80°C和120°C条件下，结晶度有明显的改善，峰更加尖锐和明确。在160°C下合成的样品显示出最锐利、最清晰的峰值，与标准HA非常相似。随着温度的升高，线条变得更加锋利，Ds尺寸也变大。较高的合成温度促进了HA结构内的晶体生长和有序性，这一点通过XRD峰值的锐化得到了证明。
图1
合成的HA颗粒以及共掺杂Cu/Sr-HA复合材料的表征。（A）SEM图像显示了在80°C、120°C和160°C下合成的HA颗粒的形态变化。比例尺：50 µm。（B）从不同温度（室温、80°C、120°C和160°C）合成的HA获得的XRD图案，并将HA与标准HA 96-230-0274的数据库进行了比较（Ds使用（211）峰通过Scherrer方程计算得出）。（C）水凝胶组分（PVA、SA）及其组合的ATR FTIR光谱。在2950 cm−1处的小负峰是由低吸收率材料的背景光谱中的异丙醇污染物引起的；它不影响光谱的其余部分（1：PVA，2：CPBA，3：PVA + CPBA，4：PVA + CPBA + Ca，5：PVA + CPBA + SA + Ca，6：PVA + CPBA + SA + Ca + HA，7：PVA + CPBA + SA + Ca + HA）。（D）共掺杂Cu/Sr-HA复合材料的FTIR光谱（1：PVA + CPBA + SA + Ca，2：PVA + CPBA + SA + Ca + HA，3：PVA + CPBA + SA + Ca + 4% Sr-HA，4：PVA + CPBA + SA + Ca + 0.5Cu%-HA，5：PVA + CPBA + SA + Ca + 1Cu%-HA，6：PVA + CPBA + SA + Ca + 0.5% Cu/4% Sr-HA，7：PVA + CPBA + SA + Ca + 1% Cu/4%Sr-HA）。（E和F）不同浓度Cu（0.5%，1%）和Sr（4%，12%）掺杂的HA颗粒的拉曼光谱。（E）拉曼位移：200–1200 cm−1。（F）拉曼位移：3400–3700 cm−1。（G）共掺杂Cu/Sr-HA复合材料的拉曼光谱（1：PVA + CPBA + SA + Ca + HA，2：PVA + CPBA + SA + Ca + 4% Sr-HA，3：PVA + CPBA + SA + Ca +0.5 Cu%-HA，4：PVA + CPBA + SA + Ca +1Cu%-HA，5：PVA + CPBA + SA + Ca +0.5% Cu/4% Sr-HA）。为了系统地阐明特定离子掺杂对晶体结构的影响，对所有在120°C下合成的单掺杂（1Cu，5Cu，4Sr）和最佳共掺杂（1Cu/4Sr）HA粉末进行了XRD相分析（见补充信息图S4）。所有掺杂样品都展示了标准HA相的特征性衍射峰，完全不存在次要金属氧化物相（例如CuO或SrO）。此外，虽然Cu和Sr离子的掺入不可避免地导致HA结晶度的轻微变化，但这种变化的程度非常有限。使用Scherrer方程对（002）反射的定量评估显示出掺杂剂诱导的晶体细化。晶体尺寸（Ds）从纯HA的40.8 nm减小到最佳1Cu/4Sr-HA的38.8 nm，对于高掺杂的5Cu和12Sr组则进一步减小到约37.0 nm。12Sr-HA的特征性衍射峰与纯HA相比向较低的2θ角度位移。这种向左的位移直接表明了层间距离的增加和单位晶胞尺寸的扩大。
使用SEM-EDX分析了（1%，5%）Cu或（4%，12%）Sr-HA的形态和元素分布（见补充信息图S1A）。Ca、磷、Cu和Sr的元素映射表明这些元素在整个HA晶体中均匀分布，证明了成功的掺杂。HA颗粒的拉曼光谱（图1E和F）显示了磷酸基团振动的典型带。425 cm−1处的带对应于O–P–O弯曲模式，588 cm−1处的带代表磷酸基团的ν4弯曲模式。957 cm−1处的带归因于ν1对称磷酸伸展。这与材料化学组成无关的光谱中没有显示出任何位移。这与1045和1075 cm−1的行为相似，它们与ν3不对称磷酸伸展模式相关。在高波数区域，结构OH伸展模式位于3572 cm−1。3572 cm−1处的OH带与957 cm−1处的磷酸带的面积比被用作羟基浓度的指标，因此可以用来衡量合成过程中的脱羟程度。纯HA组的面积比最低（0.144），表明相对羟基含量较低，而Cu的掺入逐渐增加了这一比率（1% Cu：0.170和5% Cu：0.179）。这表明Cu掺杂可能抑制脱羟作用。在HA组中，3600 cm−1处强度高的窄峰表明羟基离子具有有序结构。此外，还分析了3572 cm−1 OH带的FWHM（全宽半高），以评估结构有序性和氢键复杂性。纯HA显示出最窄的OH带（FWHM：8.569 cm−1），表明羟基环境更为有序。然而，Cu掺杂后，FWHM显著变宽（1% Cu：8.742 cm−1，5% Cu：8.948 cm−1），并且带显示出了显著的位移，反映了羟基基团氢键网络中的结构无序和复杂性增加。因此，这些拉曼结果共同表明Cu的掺入在保持HA结构中羟基的同时，也引起了结构扰动和结构无序的增加，特别是在较高Cu浓度下。在复合材料的拉曼光谱（图1G）中，3439 cm−1处的宽带是由于水凝胶组分和水的O–H伸展，而2933 cm−1处的带归因于PVA主链的C–H伸展。
合成复合材料的FTIR光谱显示出特征性带，表明复合材料成功形成（图1C和D）。在PVA + CPBA水凝胶中，1423 cm−1处出现的带表明PVA和CPBA之间形成了硼酸酯链接，而3400 cm−1左右的O–H峰变得不那么明显，表明交联过程中羟基基团的消耗。钙离子的添加进一步修改了FTIR光谱，在1620 cm−1处出现了一个新带，表明Ca与羧酸基团相互作用，可能形成了钙羧酸复合物。最终复合材料的FTIR光谱在3361 cm−1处显示了宽的O–H带（宽的O–H和吸附的水），以及1619 cm−1处的羧酸基团CO伸展。HA的加入通过607 cm−1处出现的强带得到确认，该带对应于HA典型的磷酸基团弯曲振动。1016 cm−1处的带（PO43−对称伸展）和O–H伸展带的轻微位移表明HA与聚合物基质的相互作用。含Cu和Sr-HA的复合材料的光谱显示出显著的变化，包括与磷酸基团和羟基基团相关的峰强度变化，以及1431 cm−1带的持续存在，表明金属离子存在下硼酸基团的稳定性。这些光谱表明水凝胶内的交联不受Cu和Sr-HA掺入的影响，但磷酸峰的轻微位移表明金属离子可能与HA颗粒相互作用，影响了HA的晶体结构。
3.2 膨胀和降解性能
从6小时开始，每个组的膨胀比率趋于稳定，而含有HA的复合材料的膨胀比率较低。在相同的pH值下，不同浓度的CPBA对复合材料的降解没有明显影响（见补充信息图2A和B），但在相同的CPBA浓度下，pH 8.4的CPBA显示复合材料的降解速率降低。所有组在SBF中可以保持超过28天（见补充信息图2C–F）。
3.3 注射性能和机械性能
所有组的复合材料的注射率都超过了80%（见补充信息图3J）。它们的压缩强度约为2 MPa，组间没有显著差异。随着HA结晶度的增加，复合材料的压缩模量也增加了（见补充信息图3I）。
3.4 优化后的复合材料的细胞毒性及与hMSCs和巨噬细胞的相互作用
为了确保临床生物安全性，我们故意避免了高毒性的传统化学交联剂（例如戊二醛）和刺激性溶剂（例如DMSO）。虽然过量的硼会诱导骨骼毒性，但CPBA的具体浓度和pH值被严格优化（见补充信息图3）。活细胞-死细胞染色显示，随着CPBA浓度的降低，死细胞的数量也减少（见补充信息图3A和B）。不含HA的复合材料显示的死细胞数量较多，而在pH 8.4下制备的复合材料显示出略微更高的细胞毒性，表现为死细胞数量增加。然而，所有组的整体细胞活力都保持在70%以上，表明具有可接受的生物相容性。使用Alamar blue检测法评估了代谢活性（见补充信息图3C和E）。结果表明，低浓度的CPBA（3%，4.5%）增强了hMSCs的代谢活性，而巨噬细胞的代谢活性在所有组之间保持相似，表明这些材料对每种细胞类型都没有细胞毒性。Pico Green检测法（见补充信息图3D和F）显示各组之间的dsDNA含量没有显著差异，表明所有条件下的细胞增殖都是一致的。基于膨胀、降解和细胞毒性结果，选择了优化后的CPBA（3%，pH = 8.4）进行后续复合材料合成。
3.5 含不同结晶HA的复合材料的细胞粘附性能
Alamar blue检测显示，在120°C下合成的含HA复合材料上接种的细胞表现出最高的代谢活性，表明在这个结晶度水平下细胞粘附性得到改善（见补充信息图3G）。Pico Green检测也得到了类似的结果（见补充信息图3H），支持了120°C下合成的HA促进更好细胞粘附的发现。
3.6 Cu和Sr掺杂HA复合材料的生物相容性
活细胞-死细胞染色显示，在3%和5% Cu-HA复合材料中，第1天和第7天都没有存活的细胞（见图2A），表明在这些高浓度的Cu下具有显著的细胞毒性。在含有较低浓度Cu（0.5%和1%）的复合材料中观察到第7天的细胞增殖和扩张，所有Sr浓度都促进了细胞扩张。Alamar blue数据显示，3%和5% Cu-HA复合材料中的hMSCs在第1天的代谢活性低于70%，并且这些值在第7天进一步下降，表明在这些Cu浓度下持续存在细胞毒性（见图2B和C）。0.5%和1% Cu-HA复合材料中的细胞代谢活性也在第7天后下降。相比之下，所有Sr-HA复合材料在第1天和第7天都没有细胞毒性，而且第7天后细胞代谢活性增加，没有毒性迹象（见图2F和G）。Pico Green的结果与Alamar Blue数据一致，显示较高Cu浓度组的dsDNA含量显著降低（见图2D、E、H和I）。所有组在第7天后dsDNA含量没有显著增加，可能是因为细胞以接近汇合的密度接种，限制了进一步的增殖。进行了基本的全血检测，以评估两种供体（包括两个阳性对照（LPS和PMA）和一个阴性对照（常规RPMI 1640培养基）的TNF-α产生情况，以确定基线细胞因子水平（见图2J和K）。在实验组中，TNF-α的产生保持在基线水平，与阴性对照相当，表明没有显著诱导炎症反应。
3.5 Cu和Sr掺杂HA复合材料混合体的生物相容性评估。（A）第1天和第7天hMSCs的代表性活细胞-死细胞染色图像；绿色表示活细胞，红色表示死细胞。比例尺：500 µm。第1天（B）和第7天（C）用Cu-HA复合材料培养的hMSCs的代谢活性，虚线代表根据ISO 10993-5:2009规定的70%代谢活性的阈值。在第1天（D）和第7天（E）培养的含有Cu-HA复合材料的hMSCs的DNA计数。在第1天（F）和第7天（G）培养的含有Sr-HA复合材料的hMSCs的代谢活性，虚线表示70%代谢活性的阈值，根据ISO 10993-5:2009标准用于确定细胞毒性。在第1天（H）和第7天（I）培养的含有Sr-HA复合材料的hMSCs的DNA计数。（J和K）体外全血检测，测量了两名暴露于不同复合材料的捐赠者的TNF-α水平；LPS和PMA是阳性对照。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.7
掺Cu和Sr的HA复合材料的血管生成特性
在伤口愈合检测中，24小时后3%和5%的Cu-HA复合材料中没有HUVECs，表明在这些Cu浓度下具有显著的细胞毒性（图3A）。相比之下，1%的Cu和4%的Sr-HA复合材料在24小时时表现出比对照组（常规EGM-2培养基）更好的细胞迁移能力（图3C）。管状形成检测进一步评估了不同掺杂浓度对血管生成的影响。结果表明，除了5%的Cu-HA复合材料外，不同掺杂组的处理没有显著损害HUVECs形成管状结构的能力，后者的管状形成明显减少（图3B）。在3%的Cu-HA复合材料中观察到了管状形成，这表明Matrigel可能减少了Cu的毒性，从而使更高浓度的Cu具有更广泛的应用范围。对管状形成参数（包括节点数、连接点数、分支数和总管长）的量化显示，4%的Sr-HA复合材料具有最多的节点和连接点数（图3D–G）。
3.8
掺Cu和Sr的HA复合材料的成骨特性
由于在活体-死亡染色中观察到3%和5%的Cu-HA复合材料对hMSCs具有细胞毒性，这两个组被排除在进一步的成骨实验之外。所有实验组都表现出明显的钙化，红色染色表明样品中形成了矿化的结节（图4A）。4%的Sr-HA复合材料显示出特别强的染色，表明比其他组有更多的矿物质沉积。茜素红染色的定量分析显示，包括含Sr和Cu-HA的组在内的所有组与对照组（常规成骨培养基）相比都表现出显著的钙化，其中4%的Sr-HA复合材料显示出最高水平的钙化（图4B）。这表明在这些浓度下，Sr有效地增强了复合材料的成骨潜力。ALP活性根据dsDNA含量进行了标准化，以考虑细胞数量的变化（图4C–E）。结果表明，与其他组相比，0.5%的Cu和4%的Sr-HA复合材料在第10天和第14天的ALP活性显著更高，表明成骨分化增加。这些组中观察到的ALP活性升高表明，低浓度的Cu和最佳浓度的Sr促进了早期阶段的成骨分化，这对有效的骨骼再生至关重要。
3.9
共掺Cu/Sr-HA复合材料对血管生成特性的协同效应
基于上述体外检测结果，选择了0.5% Cu、1% Cu和4% Sr-HA复合材料来进一步研究Cu和Sr在促进血管生成和成骨方面的协同作用。在伤口愈合检测中，6小时后观察到细胞迁移（图5A）。所有复合材料组都表现出比对照组更高的迁移率，其中1% Cu/4% Sr-HA复合材料的迁移率最高，显著高于HA、0.5% Cu、4% Sr和0.5% Cu/4% Sr复合材料（图5G）。这表明在最佳浓度下，Cu和Sr具有协同效应，比单独的掺杂剂更有效地促进了内皮细胞的迁移。管状形成检测显示，与对照组相比，不同复合材料培养的HUVECs显著增加了毛细血管结构（图5B）。特别是1% Cu/4% Sr-HA复合材料表现出最长的分支长度以及显著更多的节点和连接点数（图5C–F）。进行了qRT-PCR分析（图5H和I），通过检测14天培养后血管生成标志物CD31和VEGF的表达来进一步评估Cu/Sr掺杂复合材料的血管生成能力。与对照组相比，复合材料组（0.5% Cu/4% Sr和1% Cu/4% Sr）显示出显著的CD31表达水平升高，表明内皮细胞活性和血管发育增强。同时，1% Cu/4% Sr-HA复合材料中的VEGF表达显著高于所有其他实验组，进一步证实了结合最佳Cu和Sr浓度的协同血管生成效应。
3.10
共掺Cu/Sr-HA复合材料对成骨特性的协同效应
通过茜素红染色、根据DNA计数标准化的ALP活性测定以及关键成骨标志物（包括RUNX2、ALP、Col1和OCN）的定量qRT-PCR分析，评估了Cu和Sr共掺HA复合材料的成骨分化潜力。茜素红染色及其量化在14天后显示所有实验组都有明显的矿化（图6A和B）。1% Cu/4% Sr-HA复合材料显示出比其他组更显著的钙化，表明其成骨分化和矿物质沉积更优；在第10天，1% Cu/4% Sr-HA复合材料的ALP活性显著高于对照组和HA组。在第14天，这种差异更加明显。这是由于1% Cu/4% Sr-HA复合材料显示出比对照组、HA和1% Cu-HA复合材料显著升高的ALP活性，强调了其更优的成骨分化能力。通过qRT-PCR进行的基因表达分析为成骨过程的分子机制提供了额外的见解。培养14天后，0.5% Cu/4% Sr和1% Cu/4% Sr-HA复合材料中的ALP基因表达显著上调（图6F–I）。与对照组和HA组相比，其余实验组中的RUNX2表达显著上调。Col1和OCN的表达——分别是基质成熟和晚期成骨的标志物——在0.5% Cu/4% Sr和1% Cu/4% Sr-HA复合材料中升高。然而，1% Cu/4% Sr-HA复合材料中的增加在统计学上并不显著。
4. 讨论
骨骼缺陷，特别是那些大小关键的缺陷，仍然是一个主要的临床挑战。迫切需要可生物降解、免疫兼容并且能够促进成骨的人工骨移植材料。我们开发并优化了一种由PVA和SA组成的可注射双网络水凝胶，其中掺入了热合成的Cu和Sr的HA。该系统旨在同时促进成骨和血管生成，同时保持生物降解性和机械稳定性。我们的主要发现表明，在120°C合成的HA表现出适度的结晶度，提供了机械强度和细胞粘附之间的最佳平衡。低浓度的Cu（0.5–1%）和中等水平的Sr（4%）保持了细胞活力并抑制了炎症反应，而高浓度的Cu则具有细胞毒性。此外，单一的Cu和Sr-HA复合材料增强了内皮细胞迁移和成骨活性。值得注意的是，Cu和Sr的共掺杂复合材料产生了协同效应，进一步增强了血管生成和成骨反应。从生物学角度来看，骨骼再生遵循一个协调的时间序列，其中血管生成先于并紧密联系着成骨。动态水凝胶网络（硼酸盐酯和离子交联）的初始水解提供了早期、适量的表面相关离子释放，而随后120°C结晶HA颗粒的降解则提供了一个长期、持续的离子储备。重要的是，最近的晶体学见解，如Kis等人的研究显示，天然骨矿物质由单斜方磷酸钙组成。因此，我们对合成HA结晶度的调节并非旨在在原子水平上模仿天然骨，而是调整表面性能和蛋白质吸附，这一点得到了我们的粘附试验的支持。通过热合成温度控制的HA结晶度显著影响了生物和机械性能。结晶度的程度直接决定了纳米拓扑结构、表面能量和活性晶体缺陷位的密度，这些共同决定了粘附血清蛋白的初始吸附和构象呈现。通过调节结晶度，我们优化了新生生物界面，为Cu/Sr介导的信号传导提供了机械传导的基础，从而推动了随后的成骨分化。我们确定120°C为最佳温度，有效平衡了结晶度，以支持细胞活性而不牺牲机械完整性。这与Balasundaram等人的研究结果一致，他们报告低结晶度的HA对成骨细胞有更好的反应。EDX、FTIR和拉曼光谱确认了Cu和Sr在HA结构和水凝胶复合材料中的均匀掺入。作为pH依赖性交联剂，CPBA在较高pH值时更倾向于形成硼酸盐链接。通过优化CPBA的浓度和pH（3%，pH = 8.4），在复合材料的稳定性和生物相容性之间取得了平衡。关于细胞毒性，我们观察到在较高Cu浓度（≥3%）下细胞活力显著降低，这与Li等人的研究结果一致，他们报告了类似阈值下的Cu诱导的细胞毒性。虽然Sr掺杂显示出了更广泛的治疗窗口，这与Gomes Luz等人的研究结果一致，59支持其在高剂量应用中的多功能性。最佳浓度（Cu：0.5–1%，Sr：4%）增强了成血管和成骨潜力；这些浓度与先前的研究略有不同，可能是由于不同的加载系统所致。27,60 由于Cu和Sr在成骨和成血管中的作用和机制不同，我们考虑将Cu和Sr结合到HA中，以验证是否可以更有效地促进协同效应。这一过程表明，用1% Cu和4% Sr共同掺杂的HA显著增强了内皮细胞迁移和VEGF、CD31基因的表达，这与先前的观察结果一致，61，并且共同掺杂还显著提高了成骨标志物（ALP、OCN、Col1）和矿化程度，超出了单一离子掺杂的效果。TNF-α ELISA结果显示，在体外条件下，没有任何复合材料引起明显的促炎反应，这突显了它们在临床转化中的潜力。虽然之前的研究已经探讨了Cu/Sr在陶瓷、玻璃或金属基材中的共同掺杂，但很少有系统地研究HA的结晶度、离子浓度和递送形式如何共同影响生物学结果。61–63 我们的研究通过水热合成精确调节HA的结晶度来填补这些空白。它还将最佳掺杂的HA（0.5–1% Cu，4% Sr）结合到一个可生物降解的双网络水凝胶系统中。我们发现，Cu含量超过1%会在我们的系统中引起显著的细胞毒性，这与早期的报道一致；27 然而，Matrigel在内皮细胞实验中显著减少了这种效应。另一个发现是，尽管有强烈的矿化沉积，1% Cu的ALP活性却意外地低。这可能反映了ALP与后期矿化之间的时间分离，即短暂的1% Cu过量暴露最初抑制了ALP，但仍然通过Wnt/β-连环蛋白或VEGF等途径间接促进了成骨。64,65 相比之下，Li等人28认为Cu可能限制了MSCs的成骨分化，并通过Runx2途径限制了体内的骨形成；然而，这也可能是由于使用了高浓度的Cu（5 µmol L−1）。这揭示了Cu在骨骼再生过程中的复杂作用，以及需要仔细选择Cu浓度的必要性。同样，尽管Cu/Sr-HA复合材料总体上增强了成骨作用，但在第14天时，1% Cu/4% Sr-HA组显示出比仅含Sr组的RUNX2表达更低，这可能是由于协同效应加速了成骨过程，导致RUNX2峰值提前出现并随后下调。这种动态模式也在先前的研究中观察到。66,67 这些发现提供了新的机制见解，说明Cu/Sr-HA复合材料不仅促进成骨，还调节成骨分化的时间动态。然而，随着先进的药物递送策略的出现，引入空间模式的Cu/Sr域是下一代时空骨支架的一个特别有前景的概念。68
尽管有这些令人兴奋的结果，但仍应承认几个限制。首先，只评估了一个HA浓度（30%wt），因为我们的初步试验表明，HA负载超过40%wt会破坏水凝胶的均匀混合和可处理性；然而，不同的HA负载可能会影响交联、机械性能、降解行为和细胞相容性。增加HA含量还会压缩水凝胶孔隙，可能限制膨胀和细胞渗透，这表明未来的研究应该调查复合材料的孔隙率和内部结构。其次，虽然中等结晶度（120 °C HA合成）效果良好，优化后的CPBA（3%，pH = 8.4）保持了最大的生物相容性，而不影响体外降解，但可能需要调整以确保在体内不同机械负载和缺陷几何形状下的最佳性能。应明确指出，这种可注射水凝胶的初始压缩模量约为2 MPa，它是专门为非承重骨缺陷（例如，填充空腔）设计的，而不是用于分段承重应用。虽然我们的结构数据（XRD/EDS）表明HA晶格的溶解是持续且一致的，防止了细胞毒性突释，但没有通过电感耦合等离子体质谱法进行实时实际释放动力学的绝对量化；精确的药代动力学分析仍然是下一步的重要步骤。此外，某些Cu浓度（例如，1% Cu）下的ALP活性与最终矿化结果的差异表明，需要进行额外的机制研究，以澄清Cu如何影响成骨分化的每个阶段，对于基因表达研究，应该包括早期（例如，7天）和后期（例如，21天）的时间点。而且体外上清液提取试验无法完全捕捉动态表面地形和3D局部浓度梯度，这突显了未来体内缺陷模型需要阐明组织再生过程中的物理-化学相互作用。尽管我们的体外试验表明炎症反应最小，但长期体内研究是必要的，以确认慢性生物相容性并评估复合材料在生理条件下的性能。最后，可以使用诸如在水凝胶基质中的物理捕获或封装在可生物降解微球中的策略，引入BMP-2或VEGF等生长因子；这些方法可以实现局部、持续的释放，可能进一步提高水凝胶复合材料的临床效果，特别是在加速骨再生和改善临界尺寸缺陷的血管化方面。基于这些发现，提出了几个未来的研究方向。首先，需要在大鼠中建立临界大小的股骨缺陷模型，并在两个时间点（四周和八周）验证Cu/Sr共掺杂如何影响体内骨形成和新生血管生成。69,70 例如，通过改变Cu的浓度（如较低的Cu浓度促进更多骨形成或较高的Cu浓度促进血管生成），可以应用一些高生物活性材料来中和Cu的细胞毒性。其次，探索添加其他生物活性离子（例如，Mg、Zn）或生长因子可能通过协同效应进一步增强再生效果。鉴于我们水凝胶系统的灵活性，可以开发各种形式的载药配方，如可注射糊剂或涂层，以满足特定的临床需求。对于微创手术，使用带有Y形连接的双管注射器以液体状态输送快速反应的前体。或者，对于需要特定几何形状植入物的临床情况，可以在体外完全交联复合材料，然后在外科手术前将其冲压或模制成定制的宏观形状。第三，根据不同临床应用所需的机械性能，可以调整水凝胶的交联密度或将复合材料与其他聚合物或陶瓷结合，以提高承重能力。最后但同样重要的是，受到最近免疫疗法进展的启发，71复合材料也可以被设计用来调节免疫反应，例如引导巨噬细胞的极化（例如，从M0到M2），从而增强骨再生和组织整合。这种可注射和可塑的复合材料特别适合微创手术和不规则骨缺陷的治疗。这些包括治疗临界大小的长骨缺陷、颅面重建、脊柱融合移植增强以及肿瘤切除后的缺陷填充，同时应评估复合材料系统的大规模可制造性。值得注意的是，我们认为这种复合材料也可能成为Masquelet技术中不可生物降解的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）间隔物的潜在替代品，该方法广泛用于管理大骨缺陷；72,73 然而，未来的动物研究对于评估其诱导膜形成的能力和足够的结构完整性是必要的。
5. 结论
本研究证明，水热合成的HA可以成功结合到双网络PVA/SA水凝胶中，合成温度可以控制HA的结晶度，从而改变复合材料的机械性能和生物活性。通过仔细调节HA结构中Cu和Sr的浓度，我们在体外实现了对成血管和成骨的协同效应。低至中等的Cu浓度（0.5–1%）和适中的Sr浓度（4%）被证明特别有益，而超过3% Cu则会导致细胞毒性结果。机制研究揭示了成骨分化的不同阶段，包括基因和ALP表达以及矿化结节的形成，对Cu水平的敏感性不同，这突显了精确剂量优化的必要性。体外TNF-α测定表明这些复合材料不会引起显著的炎症反应。我们的发现强调了在基于HA的复合材料中平衡结晶度、离子掺杂和聚合物交联的重要性，以实现促进快速血管化和强健骨形成的双重用途系统。未来的工作将集中在体内验证、定制以及与额外生物活性剂的功能化上，以推进这种方法在临界尺寸或大骨缺陷修复中的临床应用。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性
支持本研究结果的数据可以在文章及其补充信息（SI）中找到。补充信息可获取。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra01689h。
致谢
本研究部分得到了PRosPERoS-II项目的支持，该项目由Interreg VA Flanders——荷兰项目资助，CCI拨款编号2021TC16RFCB041。此外，这项工作还得到了中国 Scholarship Council的支持，拨款编号202207720077。作者感谢Wu Zhiming先生在成骨分化实验中的技术协助。
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