过氧化氢（H2O2）在氧化应激、信号传导和病理生理学中起着核心作用，然而其在活细胞中高度动态和分层分布的特点使得精确监测成为一项重大分析挑战。在这里，我们介绍了LysoH2O2，这是一种从萘亚胺衍生的荧光探针，专为检测和成像溶酶体中的H2O2而设计。该探针利用与H2O2反应时胺基选择性地转化为羟胺基团的现象，从而显著增强荧光。这种分子设计结合了溶酶体靶向单元，确保了亚细胞特异性，实现了溶酶体微环境中H2O2变化的实时可视化。共聚焦荧光显微镜显示LysoH2O2能够在活细胞中对内源性和外源性H2O2进行高灵敏度检测，并且具有最小的细胞毒性。与传统的硼酸酯基探针不同，LysoH2O2采用了新的生物相容性化学转化方法，以实现溶酶体内H2O2的敏感和选择性监测。
在多种活性氧（ROS）家族中，过氧化氢（H2O2）具有独特的多功能性，在健康细胞中作为重要的第二信使，而在病理状态下则会导致氧化损伤。这种双重性质使得H2O2参与了从免疫防御到细胞增殖等一系列功能，其失调是包括癌症、神经退行性疾病和糖尿病在内的多种疾病的关键因素。因此，准确理解H2O2的生物学作用取决于我们能够在活细胞复杂环境中追踪其产生和流动的能力，特别是在亚细胞层面。因此，开发出在复杂生物环境中实时检测H2O2的强大而灵敏的方法仍然是一项关键的研究任务。当前的H2O2检测方法虽然多样，但常常存在局限性，包括灵敏度不足、在复杂生物环境中选择性差，以及无法提供实时原位监测等。为了实现这一目标，人们开发了多种检测策略。虽然电化学和酶法分析可以提供定量数据，但它们通常缺乏用于器官特异性分析所需的空间分辨率，并且通常仅限于细胞外环境。色谱方法虽然具有高度特异性，但不适合实时、非侵入性地成像活细胞中动态变化的H2O2。荧光显微镜结合合成分子探针，已成为监测ROS在其天然生物环境中的首选方法，提供了无与伦比的时空分辨率。
在设计用于H2O2的小分子荧光探针方面已经取得了显著进展，最近的许多努力都集中在器官特异性上。一些设计针对线粒体，利用其膜电位；其他设计则通过结合pH敏感的定向基团（如吗啉）来针对溶酶体。尽管取得了这些进展，大多数H2O2探针的化学机理仍然有限。绝大多数探针依赖于硼酸酯识别单元，该单元在H2O2的作用下发生切割，从而暴露出荧光团。此外，大多数现有探针依赖于常见的硼酸酯基团，该基团与H2O2反应产生相应的酚（或在某些情况下产生硼酸二酯）以及醌副产物，这些物质已知具有细胞毒性。相比之下，我们的工作介绍了一种针对溶酶体的探针，它首次在同一荧光团骨架内直接将胺基转化为羟胺（吖唑醇）衍生物，而不产生有害副产物。详细的反应机制示意图见图S10，补充信息S22–24。这种新型反应不仅确保了生物相容性，还扩展了H2O2的选择性监测工具箱。本文介绍了LysoH2O2，这种荧光探针克服了传统硼酸酯基设计的局限性。它引入了一种首创的生物相容性识别机制，其中H2O2直接将芳香胺转化为稳定的羟胺，避免了细胞毒性副产物的产生。通过将这种新型化学与溶酶体靶向结合，LysoH2O2能够实现对该器官中氧化还原动态的特异性、高保真成像。
LysoH2O2探头的化学结构及其在溶酶体靶向后形成溶酶体稳定羟胺功能的假设检测机制。该探针旨在通过光诱导电子转移（PeT）过程抑制来激活绿色（GFP，λexc = 488 nm，λem = 530–550 nm）共聚焦通道。
材料与测量
所有化学试剂和溶剂均从商业供应商（例如Aldrich）处购买，并按接收状态使用，除非另有说明。四氢呋喃（THF）在惰性氩气氛下通过蒸馏从钠/苯酚甲酮混合物中纯化。反应进度通过使用硅胶板的薄层色谱（TLC）进行监测，并在254和365 nm紫外光下可视化。1H和13C的核磁共振（NMR）光谱是在Bruker（400 MHz）和Jeol unity（300 MHz）光谱仪上在室温下获得的，化学位移（δ）以相对于四甲基硅烷（TMS）的百万分之几（ppm）报告。高分辨率质谱（HRMS）分析是使用配备电喷雾离子化（ESI）源的Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS系统进行的。光物理特性表征，包括荧光发射和UV-Vis吸收光谱，分别使用Edinburgh Instruments FS500荧光光谱仪（或Cary Eclipse荧光计）和Thermo Scientific Evolution二极管阵列光谱仪进行。
细胞培养、共聚焦显微镜和成像分析
人肺腺癌细胞（SK-Lu-1，ATCC HTB-57）维持在RPMI-1640培养基中，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS）、2 µM L-谷氨酰胺、每毫升100 U青霉素G和每毫升100 µg硫酸链霉素，在37 °C和5% CO2的加湿培养箱中培养。对于活细胞成像实验，将细胞以每孔20,000细胞的密度接种到8孔µ-Slides（ibidi，德国）中，并在含有10% FBS的MEM Alpha培养基中培养24小时。处理前，将细胞培养基替换为无血清的MEM Alpha。然后按照个别实验的详细说明，将细胞与不同浓度的LysoH2O2探针（1–5 µM）孵育不同时间。对于共定位研究，在添加LysoH2O2之前，根据制造商的方案将LysoTracker™ Deep Red（Thermo Fisher，50 nM）应用于细胞10分钟。为了监测细胞水泡，另一组细胞用1 µM AztecBlebTxR27染色30分钟。所有染色程序后，用预热的无血清MEM Alpha冲洗细胞两次，然后进行成像。共聚焦显微镜使用倒置的Zeiss LSM 880或Nikon A1R显微镜进行，两者都配备了在成像过程中保持37 °C和5% CO2条件的现场环境室。为了减少潜在的激光诱导伪影和自发荧光，激光功率降至0.05 mW，并记录未经处理的对照细胞的背景信号并从实验图像中扣减。对于时间进程实验，显微镜室内的细胞以5分钟间隔成像，持续时间最长为4小时。荧光图像使用给定实验中所有样本的一致设置获取。采用共染色协议来验证探针的亚细胞定位。对于定量分析，使用Fiji/ImageJ软件中的手动选择工具在至少40个细胞中手动勾画出对应于单个溶酶体的感兴趣区域（ROIs）。来自三个独立生物重复的数据被汇总，结果表示为平均值±标准误差（s.e.m.）。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，以评估观察到的差异的显著性。
化合物合成和化学表征
目标探针LysoH2O2，6-(2-吗啉基乙基)-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮，按照以下程序合成。将4-溴-1,8-萘酐（1 mmol，0.278 g）和叠氮化钠（NaN3，3 mmol，0.195 g）的溶液在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和水（20 mL，10∶1 v/v）的混合物中，在80 °C下搅拌4小时。完成后，将混合物倒入冰水中（10 mL）以诱导沉淀。收集到的固体通过过滤后溶于无水DMF（20 mL）。向此溶液中加入水性硫化氢钠（NaSH，4 mmol，0.224 g在2 mL H2O中），并在90 °C下搅拌1小时。然后用冰水淬火并酸化至弱酸性，通过过滤分离出沉淀物。将这个中间体与4-(2-氨基乙基)吗啉（1.3 mmol，0.75 mL）在DMF（10 mL）中结合，并在氩气氛下加热至120 °C并剧烈搅拌8小时。冷却至室温后，将粗产品溶于丙酮（约25 mL）并通过硅胶的快速柱层析纯化，使用二氯甲烷和甲醇（95∶5）作为洗脱剂。LysoH2O2以黄色固体的形式获得，产率为67%（0.225 g）。1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：8.61（dd，J = 26.60 Hz，1H），8.42（dd，J = 12.87 Hz，1H），8.12（dd，J = 21.45 Hz，1H），7.68（m，J = 22.32 Hz，1H），6.90（d，J = 13.73 Hz，1H），4.97（s，2H），4.34（t，J = 21.45 Hz，2H），3.71（m，J = 21.45 Hz，4H），2.72（t，J = 26.60 Hz，2H），2.63（s，4H）。13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：154.2，147.1，133.7，129.3，127.2，124.8，122.1，119.5，117.21，109.4，107.81，67.25，57.16，55.18，36.41。HRMS（ESI+）m/z：计算值C18H20N3O3 [M + H]+：326.14。实际值：326.1498。羟胺产品的1H NMR光谱（图S5）在低场区域显示两个特征性的可交换单峰。δ 10.15 ppm处的宽信号归因于–OH质子，其增宽的线宽反映了羟基质子较快的交换动力学；D2O的添加导致该信号相对于δ 11.05的–NH–共振优先衰减，进一步支持了这一归属（数据未显示）。δ 11.05 ppm处的更低场信号归因于–NH–质子，其异常的减弱归因于N–H与萘亚胺骨架侧链羰基氧之间的分子内氢键，这与相关芳基羟胺的文献值一致。该产品的稳定性强烈依赖于pH值：在模拟溶酶体环境的轻微酸性条件（pH 4.22，5 mM HTAB）下，羟胺信号随时间保持稳定，如图2A中的时间进程荧光曲线所示。相比之下，在生理pH值（7.42）下，羟胺的自由碱形式逐渐被氧化为硝基衍生物，并伴随荧光淬灭，这与图2B中描述的酸稳定机制一致。
40 µM LysoH2O2探针的荧光滴定曲线（λexc = 430 nm）在以下条件下显示：(A) 在pH 4.22和5 mM HTAB胶束介质中暴露于5当量的H2O2时，在550 nm处显示出强烈的荧光激活，在氧化为羟胺中间体后显示出稳定的荧光，证实了其在轻微酸性条件下的抗氧化性。(B) 相反，在pH 7.42的纯水介质中，会发生过度氧化为硝基衍生物，导致荧光完全淬灭。插图显示了选定波长下的荧光与H2O2时间进程曲线。箭头显示了随时间的光谱变化方向。
LysoH2O2探针的光谱特征
LysoH2O2探针的荧光滴定曲线提供了强有力的证据，支持其提出的激活机制及其对周围微环境的显著依赖性。LysoH2O2在pH 4.22和pH 7.42下与H2O2反应前后的激发和发射光谱曲线分别显示在图S11（补充信息）中，说明了在溶酶体pH下的显著荧光增强以及在中性pH下由于过度氧化导致的信号淬灭。在pH 4.22的5 mM HTAB胶束介质中的定量光物理表征显示LysoH2O2的摩尔消光系数为ε = 6550 M−1 cm−1和荧光量子产率为Φ = 0.008，而在H2O2激活后羟胺产品的摩尔消光系数增加到ε = 6890 M−1 cm−1和荧光量子产率为Φ = 0.21，相当于26.3倍的荧光增强，这与PeT抑制机制一致（表S1，补充信息）。最初，探针在550 nm处显示出微弱的荧光信号；然而，在暴露于H2O2后，在这个波长下观察到荧光强度的显著增强。这种激活是由于氨基到萘亚胺荧光团的光诱导电子转移（PeT）过程被抑制。为了进一步支持基于PeT的激活机制，构建了一个前沿轨道能量对齐图，比较了LysoH2O2及其羟胺产品在PBE/6-31G(d,p)理论水平上的情况（图S12，补充信息）。NBO分析确认了完整探针的最高未成对电子（HOMO）中氮原子的孤对电子特性显著（HOMO = −5.85 eV），这与活跃的施主-受体PeT过程一致，该过程会抑制荧光。当探针氧化成羟胺后，孤对电子对HOMO的贡献显著降低（HOMO = −5.92 eV），且HOMO–LUMO间隙从2.25 eV扩大到2.41 eV（ΔΔE = +0.16 eV），这证实了氧化降低了施主轨道的能量，抑制了PeT过程，并恢复了荧光发射。这种基于PeT的机制在相关的萘酰亚胺系统中已有充分记录，并解释了图2中观察到的荧光“开启”行为。值得注意的是，该探针仅对H2O2有选择性响应，而对其他生物相关活性氧（ROS）如HOCl、ONOO−、˙OH、1O2和O2˙−则没有显著的荧光激活作用。相反，只有自由基类物质会导致荧光部分抑制，这在化学上是预期的，因为自由基与探针发生相互作用。重要的是，这种抑制并未显著干扰所需的体外H2O2监测，如图3所示。
（A）在pH 4.22和5 mM HTAB胶束介质中，40 µM LysoH2O2探针在5当量H2O2及各种ROS存在下的荧光时间曲线（λexc = 430 nm，λem = 550 nm）。（B）相应的条形图展示了荧光强度的变化。一旦通过形成羟胺中间体达到最大荧光发射，信号在模拟溶酶体环境的条件下保持稳定，特别是在pH 4.22的5 mM HTAB胶束介质中。这种稳定性是一个关键发现，因为它证实了在微酸性条件下羟胺物种得以保留，从而防止了进一步氧化并保持了稳定的荧光响应。相比之下，当探针在生理pH（7.42）的纯水介质中孵育时会发生过度氧化，导致相应的硝基衍生物的形成并完全丧失荧光。通过长时间动力学实验比较pH 4.22和pH 7.42下活化探针的荧光稳定性（图S6，SI文件），显示出显著差异：在溶酶体pH下，先是一个稳定的平台期持续约44分钟，随后是缓慢的伪一级衰减（kobs = 0.0076 min−1，t1/2 = 91 min，R2 = 0.996），90分钟后仍保留70.2%的最大信号强度。在中性pH下，过度氧化遵循S型动力学，衰减速率常数高出4.4倍，导致在同一时间框架内几乎完全丧失荧光信号。这些动力学数据定量确立了羟胺产物在溶酶体条件下的稳健稳定性以及酸保护机制的效率。这种明显差异突显了酸性溶酶体环境在稳定荧光产物和维持信号强度方面的保护作用，强调了局部环境因素在调节探针光物理响应中的重要性。重要的是，羟胺衍生物的氧化产物通过ESI-HRMS和1H NMR光谱进行了化学鉴定，确认了–NH–OH官能团的存在（图S7–S9，SI文件）。这些特性使得LysoH2O2能够高度适配于具有增强选择性和成像深度的亚细胞靶向组。该探针设计成功利用了溶酶体的独特pH值来控制氧化反应，对H2O2提供选择性和稳定的响应，同时避免了在中性环境中过度氧化导致的信号丢失。
在体外建立了探针的机制和稳定性之后，我们接下来评估了其在活细胞内的功能性。我们的主要目标是确认其能够准确地靶向溶酶体，验证其对H2O2的响应能力，并展示其在追踪如自噬等生理过程中的氧化还原变化中的应用。通过MTT检测细胞活力分析，确认LysoH2O2在SK-Lu-1细胞的工作浓度范围（1–5 µM）内表现出约80%的细胞活力（约20%的细胞毒性），证明了其在活细胞荧光成像应用中的生物相容性（图S1，SI）。共聚焦显微镜成像验证了LysoH2O2成功靶向溶酶体。虽然在标准设置下探针的绿色通道荧光较弱，但通过优化激光功率和探测器增益，在蓝色通道（DAPI，λexc = 440 nm，λem = 480–500 nm）实现了稳健的信号检测。在这些条件下，LysoH2O2有效进入SK-Lu-1细胞并积累在离散的细胞质结构中，产生典型的溶酶体特征的明亮、点状染色模式。为了明确确认这种亚细胞定位，我们使用了已建立的溶酶体标记物LysoTracker™ Deep Red进行了共染色实验。结果荧光图像显示LysoH2O2的蓝色信号与LysoTracker的红色信号之间存在显著的重叠（图4）。这一视觉相关性得到了定量分析的强烈支持，其皮尔逊相关系数高达0.935。进一步的确认来自van Steensel的互相关函数（CCF），结果显示接近零的峰值，表明两种信号的空间注册非常紧密。这些数据共同提供了确凿的证据，表明吗啉单元有效地将LysoH2O2引导至酸性溶酶体环境，满足了后续H2O2传感应用所需的亚细胞特异性。
在确定了LysoH2O2在体外的机制和稳定性后，我们接下来评估了其在活细胞内的功能。我们的主要目标是确认其能够准确靶向溶酶体，验证其对H2O2的响应能力，并展示其在追踪自噬等生理过程中的氧化还原变化中的应用。通过MTT检测细胞活力，确认LysoH2O2在SK-Lu-1细胞的工作浓度范围内（1–5 µM）表现出约80%的细胞活力（约20%的细胞毒性），证明了其在活细胞荧光成像应用中的生物相容性（图S1，SI）。共聚焦显微镜成像验证了LysoH2O2成功靶向溶酶体。虽然探针的绿色通道荧光在标准设置下较暗，但通过优化激光功率和探测器增益，在蓝色通道（DAPI，λexc = 440 nm，λem = 480–500 nm）实现了稳健的信号检测。在这些条件下，LysoH2O2有效进入SK-Lu-1细胞并积聚在离散的细胞质结构中，产生典型的溶酶体特征的明亮、点状染色模式。为了明确确认这种亚细胞定位，我们使用了已建立的溶酶体标记物LysoTracker™ Deep Red进行了共染色实验。结果荧光图像显示LysoH2O2的蓝色信号与LysoTracker的红色信号之间存在显著的重叠（图4）。这种视觉相关性得到了定量分析的强烈支持，其皮尔逊相关系数高达0.935。进一步的确认来自van Steensel的互相关函数（CCF），该函数显示接近零的峰值，表明两种信号的空间注册非常紧密。这些数据共同提供了确凿的证据，表明吗啉单元有效地将LysoH2O2引导至酸性溶酶体环境，满足了后续H2O2传感应用所需的亚细胞特异性。
亚细胞共定位显示，在SK-Lu-1细胞中，5 µM LysoH2O2（蓝色，DAPI：λexc = 440 nm，λem = 480–500 nm）与LysoTracker Deep Red（红色，Cy5：λexc = 647 nm，λem = 720）的共定位。右侧面板显示了相应的皮尔逊相关系数（PC > 0.93）和van Steensel的互相关函数（CCF）图，提供了荧光通道之间空间相关性的定量评估，表明其具有高靶向选择性。共定位以假彩色叠加图（绿色-红色重叠部分显示为黄色）的形式展示。比例尺 = 20 µm。接下来，我们用生理相关的H2O2刺激物对探针进行了测试。用200 µM的外源性H2O2处理细胞后，探针迅速且明显地被激活，在绿色荧光通道（λexc = 488 nm，λem = 530–550 nm）中显示出最佳发射，证明了探针能够在细胞环境中响应升高的过氧化物水平，并至少保持30分钟的稳定荧光信号（图5A）。H2O2刺激后从蓝色通道转移到绿色通道的检测直接反映了PeT的抑制：完整的探针在蓝色通道（λexc = 440 nm，λem = 480–500 nm）中仍有残余发射，而羟胺产物在绿色通道（λexc = 488 nm，λem = 510–550 nm）中显示出红移且强度显著增强。
LysoH2O2（7 µM）探针能够在活细胞中检测到外源性和内源性来源的H2O2。（A）对200 µM外源性H2O2的荧光响应，开始时使用蓝色（DAPI：λexc = 440 nm，λem = 480–500 nm）通道，然后是绿色（GFP：λexc = 488 nm，λem = 510–550 nm）通道。（B）对PMA诱导的内源性H2O2产生的响应，在溶酶体点状结构中显示出信号，在线粒体中显示出微弱响应（黄色箭头）。从左到右的图像分别是明场、初始蓝色通道和绿色通道的时间序列，显示信号增加。（C）作为时间函数的定量平均归一化荧光强度曲线（±s.e.m.），分别对应外源性H2O2（左，n = 72个溶酶体）和PMA刺激（右，n = 85个溶酶体），数据来自ImageJ ROI分析的共聚焦时间延迟图像。箭头表示刺激添加的时间（t = 0）。比例尺 = 20 µm。更重要的是，使用phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）刺激，这是一种已知的主要通过NADPH氧化酶（NOX）系统诱导内源性H2O2产生的物质，28在溶酶体点状结构中引发了类似的荧光“开启”响应（图5B）。有趣的是，PMA诱导的内源性ROS产生也在线粒体位置产生了微弱的绿色通道信号（图5B，黄色箭头），而在直接添加外源性H2O2时则没有这种信号（图5A）。可能有几个解释可以说明这一现象：（i）NOX衍生的H2O2从其产生部位被动扩散到邻近的线粒体；（ii）探针有一小部分位于线粒体中，使其对局部产生的ROS敏感；或者（iii）NOX激活后的器官间ROS通信。要区分这些可能性，需要进一步的研究，例如使用线粒体特异性ROS清除剂或双器官共成像策略，这是未来工作的一个重要方向。LysoH2O2探针的一个关键特点是其在溶酶体复杂氧化还原环境中对H2O2的特异性响应。虽然其他活性物质，如羟基自由基（˙OH）可能存在，并可能潜在地抑制形成的荧光团，但重要的是要注意这些物质不会启动荧光的开启。激活机制是由H2O2介导的羟胺氧化特定触发的，这种反应在其他ROS/RNS条件下不会发生。因此，观察到的荧光增强可以确信地归因于H2O2，证明了探针在活细胞环境中的高操作特异性。外源性H2O2添加和内源性PMA刺激之间的差异响应特别有启发性。在线粒体位置出现的线粒体信号表明细胞的天然信号网络正在被激活。PMA诱导的NOX活性可能产生了局部化的氧化还原信号，该信号传播到线粒体，可能是器官间通信事件的一部分，如氧化还原中继或钙信号传导。这一现象如果直接使用外源性H2O2添加则会被完全掩盖。LysoH2O2捕捉到这一细微差异的能力突显了其独特价值；它不仅仅是一个被动报告H2O2浓度的工具，而是一个用于实时可视化特定器官内ROS信号级联的主动工具。这使LysoH2O2能够在细胞生物学中调查关于氧化还原信号如何生成、包含和在器官间传输的基本问题。最后，为了展示探针在细胞生物学中的实际应用，我们使用LysoH2O2监测SK-Lu-1细胞自噬过程中的H2O2动态。自噬是通过饥饿（HBSS缓冲液）和化学试剂雷帕霉素29,30诱导的。时间延迟共聚焦显微镜显示，自噬诱导导致新形成的荧光点状结构中的H2O2特异性荧光显著增加，与自噬小体和自噬溶酶体一致（图6）。我们注意到，这些结构是否为真正的自噬小体并未通过共标记自噬小体特异性标记物（例如LC3）来确认；它们被归类为自噬小体是基于它们的形态、动态的溶酶体融合和分裂行为，以及饥饿诱导的自噬与溶酶体ROS生成之间的已知关联29。计划使用LC3报告基因进行共免疫荧光确认。然后，使用Lyso-H2O2探针可视化了自噬过程中的溶酶体动态相互作用。如图6所示，共聚焦时间延迟成像显示了在无血清培养基中孵育的细胞的溶酶体融合和分裂事件序列。在图6a中，观察到两个溶酶体经历了一个特征的“亲吻与转移”事件，它们逐渐接近、短暂相互作用以交换内容物，然后分离。在图6b中，捕捉到一个部分融合事件，其中溶酶体建立了稳定的接触区而没有完全合并。图6c描绘了一个完全融合事件，其中两个溶酶体完全合并成一个器官，同时保持相对于周围结构的独立运动性。最后，在图6d中，我们记录了一个罕见的解离事件，其中一对融合的溶酶体逐渐分离，直到完全解体和空间分离。这一结果成功捕捉到了溶酶体H2O2通量的动态、生物学相关的增加，强调了探针的敏感性及其揭示反应性氧物种在基本细胞过程中的作用的潜力。然而，目前的研究没有包括使用自噬抑制剂（例如bafilomycin A1或3-甲基腺嘌呤）的生理学阴性对照，这将会排除观察到的荧光增强是由一般应激反应引起的。这项重要的控制是未来使用LysoH2O2进行自噬相关研究时的一个优先考虑方向。
LysoH2O2检测到活细胞中外源性和内源性来源的H2O2。（A）对200 µM外源性H2O2的荧光响应，开始时使用蓝色（DAPI：λexc = 440 nm，λem = 480–500 nm）通道，然后是绿色（GFP：λexc = 488 nm，λem = 510–550 nm）通道。（B）对PMA诱导的内源性H2O2产生的响应，在溶酶体点状结构中显示出信号，在线粒体中显示出微弱响应（黄色箭头）。从左到右的图像分别是明场、初始蓝色通道和绿色通道的时间序列，显示信号增加。（C）作为时间函数的定量平均归一化荧光强度曲线（±s.e.m.），分别对应外源性H2O2（左，n = 72个溶酶体）和PMA刺激（右，n = 85个溶酶体），数据来自ImageJ ROI分析的共聚焦时间延迟图像。箭头指示刺激添加的时间（t = 0）。比例尺 = 20 µm。更重要的是，使用phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）刺激，这是一种已知的通过NADPH氧化酶（NOX）系统主要诱导内源性H2O2产生的物质，28在溶酶体点状结构中引发了类似的荧光“开启”响应（图5B）。有趣的是，PMA诱导的内源性ROS产生也在线粒体位置产生了微弱的绿色通道信号（图5B，黄色箭头），而在直接添加外源性H2O2时则没有这种信号（图5A）。可能有几种解释可以说明这一观察结果：（i）NOX衍生的H2O2从其产生部位被动扩散到邻近的线粒体；（ii）探针的一小部分位于线粒体中，使其对局部产生的ROS敏感；或者（iii）NOX激活后的器官间ROS通信。要区分这些可能性，需要进一步的研究，例如使用线粒体特异性的ROS清除剂或双器官共成像策略，这代表了未来工作的一个有吸引力的方向。LysoH2O2探针性能的一个关键方面是其在溶酶体复杂氧化还原环境中对H2O2的特异性响应。虽然其他活性物质，如羟基自由基（˙OH）可能存在并可能抑制形成的荧光团，但重要的是要注意这些物质不会引发荧光的开启。激活机制是由H2O2介导的羟胺氧化特定触发的，这种反应在其他ROS/RNS条件下不会发生。因此，观察到的荧光增强可以确信地归因于H2O2，证明了探针在活细胞环境中的高操作特异性。外源性H2O2添加和内源性PMA刺激之间的差异响应特别有启发性。在内源性ROS产生期间出现线粒体信号表明细胞的天然信号网络正在被激活。PMA诱导的NOX活性可能产生了局部的氧化还原信号，该信号可能被传播到线粒体，可能是作为器官间通信事件的一部分，如氧化还原中继或钙信号传导。这种现象如果直接应用外源性H2O2将会被完全掩盖。LysoH2O2捕捉到这种细微差异的能力突显了其独特价值；它不仅仅是一个被动报告H2O2浓度的工具，而是一个用于实时可视化特定器官内ROS信号级联的主动工具。这使LysoH2O2能够在细胞生物学中研究关于氧化还原信号如何生成、包含和在器官间传输的基本问题。最后，为了展示探针在细胞生物学中的实际应用，我们使用LysoH2O2监测了SK-Lu-1细胞自噬过程中的H2O2动态。自噬是通过饥饿（HBSS缓冲液）和化学试剂雷帕霉素29,30诱导的。时间延迟共聚焦显微镜显示，自噬诱导导致新形成的荧光点状结构中的H2O2特异性荧光显著增加，与自噬体和小体自噬溶酶体一致（图6）。我们注意到，这些结构的分子身份尚未通过共标记自噬小体特异性标记物（例如LC3）来确认；它们被归类为自噬小体是基于它们的形态、动态的溶酶体融合和分裂行为结论
本研究介绍了一种名为Lyso-H2O2的荧光探针，该探针基于萘酰亚胺类化合物，专为选择性检测溶酶体内的过氧化氢而设计。该探针的核心创新在于其独特的传感机制：过氧化氢能够触发胺类物质转化为羟胺，而这一转化过程在溶酶体天然酸性的环境下得到有效稳定，从而防止过度氧化，确保荧光信号的可靠性和响应性。通过活细胞中的共聚焦显微镜实验验证，该探针具有出色的溶酶体特异性，并能够追踪来自外部刺激以及细胞内部过程（如自噬）的过氧化氢流动。更广泛而言，Lyso-H2O2填补了氧化还原生物学领域的一个重要方法空白，将研究重点从已被广泛研究的线粒体转向了同样重要但研究较少的溶酶体这一细胞器。这一工具为挑战以线粒体为中心的细胞氧化信号传导理论提供了新的化学手段。我们预计Lyso-H202将成为未来研究的基础工具，能够实现同时监测不同细胞器中活性氧（ROS）的多重检测。此类方法对于解析细胞器官间复杂的氧化还原通讯机制及其对细胞生理和疾病机制的深远影响至关重要。
作者贡献
Ricardo Flores-Cruz：方法学研究、成像显微镜技术；Nitzya Ruiz-Robledo：合成与化学性质分析；Adriana Romo-Pérez：细胞培养与成像实验；Arturo Jiménez-Sánchez：数据分析、原始稿件撰写及资金筹集。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据获取
本研究的所有支持性数据均包含在文章及其补充信息（SI）中。本研究过程中未开发新的代码或软件。原始数据文件可应合理请求向通讯作者索取。补充信息包括原始光谱数据（核磁共振NMR、高分辨率质谱HRMS、紫外-可见光谱UV-vis及荧光光谱）及其他实验细节，详见DOI：https://doi.org/10.1039/d6ra00730a。
致谢
衷心感谢DGAPA-UNAM对该项目(PAPIIT IA202025)的财政支持。J. L. C.-M. 感谢CONAHCyT提供的奖学金CVU:740981。同时感谢Ruth Rincón Heredia（IFC-UNAM影像学部门博士）、Adriana Romo Pérez（博士）和Teresa Ramírez Apán（理学硕士）在成像显微镜技术方面的协助，以及R. G. M. 感谢DAIP-UG（066/2024）项目和CONAHCyT（CB-2016-285622）项目的资助。D. G.-G. 感谢CONAHCyT提供的奖学金（1233507/4039492），S. C. R. L. 感谢CONAHCyT提供的奖学金（701343/582679）。
打赏
